食管癌微卫星不稳定的研究进展

霍亚兰综述 刘风玲审校

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发生与诸多因素有关。近年来随着分子生物学的发展，越来越多研究发现，细胞恶性转化与其遗传物质(即基因组)的不稳定性有关，在分子遗传学方面主要表现为微卫星不稳定(micro--satellite instabitity，MSI)，而食管癌是1种具有遗传倾向的疾病，微卫星不稳定与其发生、发展及预后都有关，是目前研究的热点。现就食管癌MSI的研究作一综述。

1 微卫星与微卫星不稳定

微卫星(MS)为短的基因片段或由核苷酸串联而成的重复序列，也称作短小串联重复序列(STRs)，广泛分布于人类基因组中，由1～6个核苷酸组成，常见的有2、3、4核苷酸重复序列，最常见的是二核苷酸重复序列(CA/GT)n。(CA/GT)n中n为重复次数，通常为15～60次，重复单位结构相同。MS一般处于DNA编码区域附近，也可以位于内含子或启动子中，在人群中表现为遗传稳定性、高度个体特异性及高度多态性。

MS在肿瘤基因调控中发挥着重要作用。从基因水平上，细胞发生恶变常伴有原癌基因或抑癌基因的突变、扩增、重排或丢失，MS通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白结合调控基因重组而发挥作用。肿瘤分子遗传学研究表明，1个正常细胞恶性转化需要多个遗传改变的积累，一类是癌基因与抑癌基因的改变，另一类就是发生MSI。

MSI是指在各种致瘤因素作用下，细胞中某一MS由于DNA复制错误(replication error，RER)引起的重复序列的改变。它的产生机制是DNA在复制或修复过程中，DNA滑动或滑动链与互补链的碱基错配或有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换，导致重复单位的插入与缺失，造成等位基因的结构、大小发生改变，进而DNA基因序列发生改变。MS序列的改变使MS不能正常发挥调控作用，引起细胞增殖、分化均发生异常，导致肿瘤的发生。MSI包括核微卫星不稳定性(nuclearmicrosatellite instabitity，nMSI)和线粒体微卫星不稳定性(mitochondrialmicrosatellite instability，mtMSI)。MSI仅在肿瘤细胞中表达，广泛存在于大肠癌、胃癌、子宫内膜癌等［1，2］中，在食管癌中也有表达，在肿瘤基因调控中起着重要作用，参与肿瘤的发生与发展。

人类的基因组存在基因错配修复系统(mismatch repair system MMR)，是人体细胞修复DNA碱基错配的安全保障体系，大部分发生错配的基因因此可恢复正常，从而保持遗传物质的完整性和稳定性。目前所知的人类错配修复系统中含有6个错配修复基因，分别为 hMSH2、hMSH3、hMSH6/hGTBP、hMLH1、hMLH3、hPMS1［3］。该基因家族中任一基因突变，都会使细胞错配修复功能缺陷，错配修复蛋白功能失活，基因碱基错配率升高。错配的碱基如果发生于MS位点，就会造成MSI，诱发癌基因激活或者抑癌基因失活，产生遗传不稳定性，导致肿瘤易感。在MMR存在缺陷的细胞中，编码区域的MS序列发生插入或缺失几个核酸碱基被认为是MS肿瘤形成的重要分子机制［4］。核酸碱基的插入或缺失使多个包括控制细胞增殖和存活的基因突变，使细胞向恶性转变。位于编码区的靶基因如生长因子受体基因TBGβRⅡ和IGFⅡR、BAX等发生MS突变，多表现为基因杂合性丢失、基因表达能力缺失或下降、蛋白产物活性降低或丧失。由此，有学者提出通过新的基因靶点的确认有助于阐明MMR缺陷肿瘤演变路径，为肿瘤的治疗提供思路［5］。

美国国立癌症研究所(NCI)推荐5个MS位点，即BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250。在肿瘤的检测中，阳性位点≥40%(即推荐的5个位点中有2个及以上发生突变)为高度MSI(MSI-H)，阳性位点＜40%(即推荐的5个位点中只有1个发生突变)为低度MSI(MSI-L)，无阳性位点为微卫星稳定(misrosatellite stability，MSS)［6］。目前进行的研究大多数是对MSI位点进行检测研究，进而指导临床。MSI位点检测可作为临床筛查恶性肿瘤高危人群的分子手段，在肿瘤的诊断和遗传性肿瘤的预防中有重要意义。

2 食管癌中MSI的研究

2.1 食管癌的病理类型与MSI

食管癌的病理类型有鳞状细胞癌、腺癌及小细胞癌等。不同病理类型的食管癌MSI的发生率也不同。有研究［7］表明MSI主要发生于食管小细胞癌和鳞状细胞癌中，小细胞癌中MSI的检出率为100%，鳞状细胞癌MSI的检出率为13.8% ～64.0%，提示MSI是食管鳞状细胞癌发生过程中的早期分子事件。Cai等［8］发现MSI是食管鳞状细胞癌的重要相关因素，但与临床病理特征无显著性差异。赵雍凡等［9］检测的57例食管鳞状细胞癌中 23例发生 MSI(40.3%)，3例小细胞癌均发生 MSI(100%)。翟瑜等［10］检测了23例食管鳞状细胞癌，6例发生MSI(26.1%)，5例小细胞癌均检出MSI(100%)。由此更加证实，食管小细胞癌中更易检出MSI，而鳞癌的MSI检出率也较高。

2.2 MSI与食管癌临床特征之间的关系

有报道［11］指出MSI与肿瘤的分期及预后关系不大。吴颜晖等［12］研究发现食管癌中微卫星不稳定性、10q23微卫星标记的杂合性缺失及总等位基因不平衡与患者的TNM分期及淋巴结转移之间无显著相关性。YAN KUN等［13］在检测MSDNA不稳定时发现MSI与食管癌的临床分期、病理分级、浸润深度、淋巴结转移之间无显著性差异，研究结果基本一致。

2.3 MSI与幽门螺旋杆菌感染的关系

消化道肿瘤与幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的关系一直是近年来研究的热点，食管癌中Hp感染也越来越受到关注。很多研究发现Hp感染与食管癌，尤其是与食管鳞癌的发生有密切关系。陈健等［14］研究显示正常人食管Hp的感染率为21.25%(17/80)，食管癌患者的感染率为92.5%(74/80)。Ye等［15］及 Wang等［16］研究均认为，Hp 感染与食管鳞癌的发病率呈正相关。Hp的慢性感染很可能是食管癌发生的起始因素，Hp感染、种植，刺激机体产生亚硝胺，破坏食管黏膜，使其暴露于高酸环境的可能性增加，引起慢性炎症，进而诱发食管癌。Hp感染还可能参与食管癌发生过程中的血管形成。

在Hp感染与MSI之间是否存在相关性的研究比较少。吴礼高等［17］研究提示食管癌组织中的Hp感染尤其Hp-L型感染是常见现象，与食管鳞状细胞癌的发生密切相关。该研究指出，在Hp感染引发炎症时，产生大量氧自由基，引起mtDNA损伤;加上可能存在DNA聚合酶r的修复功能缺陷，最终导致mtMSI。由此推测，Hp感染可能通过氧化损伤食管黏膜，引发mtMSI而致肿瘤发生。

2.4 食管癌MSI与地域的关系

食管癌中MSI的地域性差异似乎不很明显。李小东等［18］对中国南方(潮汕地区)食管鳞癌的研究发现，食管鳞癌患者D5S107和D5S408的杂合性丢失率分别为48.5%和34.3%，推测MSI在中国南方食管癌发生过程中可能不占主导地位。中国北方人群错配修复基因突变谱广泛，突变类型多样［19］，目前食管癌MSI的相关资料和信息尚不足，需要进一步进行研究、验证。

2.5 食管癌中COX-2与MSI的关系

环氧化酶(COX)是生物合成前列腺素的限速酶，COX-2是其1个亚型，在大多数组织中表达极少或几乎无表达，但在肿瘤组织中表达显著增加。COX-2调节肿瘤的发展和凋亡，与肿瘤的发生有密切关系，是目前研究的热点之一。多项研究表明，COX-2在食管癌、胃癌、大肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中均呈高表达。

COX-2在食管癌的发生、发展中的作用机制尚未完全阐明，可能与以下因素有关:①食管癌中COX-2的表达与肿瘤微血管密度、VEGF表达呈正相关［20］，还可促进肿瘤血管形成;②COX-2过度表达可以促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡。有研究证明，COX-2活性增高会提高凋亡抑制基因bcl-2的表达水平及降低促凋亡蛋白Bax的表达水平［21］;③增加肿瘤细胞的侵袭力;④免疫抑制作用。此外，对生物膜和线粒体的氧化损伤也是诱发肿瘤的重要原因。

对于肿瘤中MSI与COX-2的关联，很多研究表明，在MSI肿瘤中，如胃癌［22］、结直肠癌［23］中 COX-2 的表达是下降的，而微卫星稳定的肿瘤中COX-2的表达相对较高。在食管癌MSI与COX-2的研究中，基本与其他肿瘤一致。王宏霞等［24］经研究发现MSI食管鳞状细胞癌COX-2蛋白的表达率与MSS食管鳞状细胞癌有显著差别。COX-2多在MSS食管鳞状细胞癌中呈高表达，而在MSI食管鳞状细胞癌表达降低，表明COX-2与MSI食管鳞状细胞癌的发生关系不大，而与MSS食管鳞状细胞癌的发生关系密切。提示在食管鳞状细胞癌发生发展过程中存在MSI途径，并常伴有COX-2低表达。

3 MSI的检测

3.1 检测方法

检测MSI的方法很多:变性凝胶电泳，变性高效液相色谱分析，免疫组化法，聚合酶链式反应(PCR)，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)法，体外偶联的转录翻译技术(IVTT)等。目前较多应用的是PCR检测法，它是对DNA片段进行扩增，对其长度进行直接检测，具有敏感性高，稳定性好等优点，在临床及科研中广泛应用。

近年来，自动测序仪片段分析MSI这一检测方法正被越来越多地采用，特别是高通量双荧光标记微卫星检测系统(high resolution microsatellite analysis system，HRFMA)，因其能够解决传统方法的大部分问题，已备受关注［25］。HRFMA法是用带有2种荧光标记的引物以Taq聚合酶分别扩增待测样本和对照样本基因组DNA的靶序列，然后将PCR产物作变性处理后等量混合，再用测序仪对自动片段进行分析。在自动片段分析技术中，波形的位置表示PCR产物的精确长度，波形的高低表示PCR产物的相对量。同时电泳待测样本的扩增序列和对照样本扩增系列，可以直接比较结果，进而消除两者因泳动率产生的误差。

3.2 检测标本

目前对MSI进行检测多选用肿瘤标本，也有选用尿液、胸腹腔积液等的。国内张树鹏等［26］应用多重荧光PCR、基因测序和FISH法分别检测尿液细胞DNA MS的不稳定性，结果显示，经上述方法检测，早期确诊和提高体液癌细胞阳性率(90%)。且指出细胞HE染色后也可以进行MSI的检测，适于晚期肿瘤胸腹腔积液的检查。

此外，LIU Ming等［27］选用食管癌患者的血清样本检测，判断肿瘤组织中是否存在MS变化。结果显示，食管癌患者血清中微卫星缺失检出阳性率超过90%，由此认为，血清MSI分析将有助于从高危人群中检出早期食管癌患者。但对血清样本MSI分析存在临床应用的可行性。通过血清样本的MS分析可判定早期食管癌及食管癌的高危人群中恶性肿瘤的存在，循环血血清中DNA的微卫星缺失有望成为新一代的肿瘤分子标记物。

MSI分析的可操作性就在于它能在多种不同的样本中进行，如血清和各种体液。通过检测MSI，可发现早期食管癌及高危人群，且检测MSI方法简便，价钱低廉，结果可靠，可以作为1种新型的、有效的用于预测肿瘤发生及早期诊断肿瘤的分子手段进行推广，对提高食管癌的预防、诊断和治疗水平，对降低食管癌的发病率和死亡率有着重要的意义，具有潜在的、巨大的、乐观的应用前景。我们相信，随着食管癌发生机制的进一步阐明，未来会有更多的分子标记物用于患者的诊断和治疗。

［1］ Changhyeok An，In-Seon Choi，James C，et al.Prognostic Significance of CpG Island Methylator Phenotype and Microsatellite Instability in Gastric Carcinoma〔J〕.Clinical Cancer Research，2005，15(11):656.

［2］ Israel Zighelboim，Paul J，Goodfellow，et al.Microsatellite Instability and Epigenetic Inactivation of MLH1 and Outcome of Patients With Endometrial Carcinomas of the Endometrioid Type〔J〕.Journal of Clinical Oncology，2007，20(25):2042.

［3］ LIU Zhuo，WU Jian-xin.Advances of researches on the composition and function of DNAmismatch repair system〔J〕.Progress in Modern Biomedicine，2008，8(6):1162.

［4］ Gologan A，Krasinskas A，Hunt J，et al.Performance of the revised Bethesda guildines for indentification of colorectal carcinomas with a high level of microsatellite instability〔J〕.Arch Pathol Lab Med，2005，129(11):1390.

［5］ Laghi L，Ranzani GN，Bianchi P，etal.Frameshiftmutations of human gastrin receptor gene(hGARE)in gastrointestinal cancerswithmicrosatellite instability〔J〕.Lab Invest，2002，82(3):265.

［6］ Kurzawski G，Suchy T，Debniak J，et al.Importance ofmicrosatellite instability(MSI)in colorectal cancer:MSI as a diagnostic tool〔J〕.Annals of Oncology，2004，15(4):283.

［7］ Falkenback D，Johansson J，Halvarsson B，et al.Defective mismatchrepair as a minor tumorigenic pathway in Barrett esophagus associatedadenocarcinoma〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2005，157(1):82.

［8］ Cai YC，So CK，Nie AY，et al.Characterization of genetic alter-ation patterns in human esophageal squamous cell carcinoma using selected microsatellitemarkers spanningmultiple loci〔J〕.Int JOncol，2007，30(5):1059.

［9］ 赵雍凡，张军航，陈国第，等.中国人原发性食管癌微卫星DNA序列不稳定性研究〔J〕.中国胸心血管外科临床杂志，2000，7(1):32.

［10］ 翟 瑜，苏 力，杜 权，等.食管癌组织3p、18q位点微卫星DNA序列不稳定性的研究〔J〕.诊断学理论与实践，2005，4(2):145.

［11］ Rugge M，Bersani G，Bertorelle R，et al.Microsatellite instability and gastric non-invasive neoplasia in a high risk population in Cesena，Italy〔J〕.JClin Pathol，2005，58(8):805.

［12］ 吴颜晖，陈汉春，刘新发，等.中国人食管鳞癌10q23微卫星不稳定和杂合性缺失初步探讨〔J〕.中国肿瘤临床，2004，31(8):466.

［13］ YAN Kun，WANGMing rong，FANGDian chun，etal.Study of the instability ofmicrosatellite DNA and its relationship with clinical pathological parameters in esophageal cancer〔J〕.ACTA ACADEMLAE MEDICINAE MILITARIS TERTLAE，2004，17(26):1570.

［14］ 陈 健，施民新，刘继斌.食管癌患者检测幽门螺旋杆菌的临床意义〔J〕.现代肿瘤杂志，2009，17，(10):1866.

［15］ Ye Weimin，Held Maria，Lagergren Jesper.Helicobacter pylori infection and Gastric Atrophy:Risk of Adenocarcinoma and Squamous-Cell Carcinoma of the Esophagus and Adenocarcinoma of the gastric Cardia〔J〕.Journal of the National Cancer Institute，2004，96(5):388.

［16］ Wang Z，Tang L，Sun G，et al.Etiological study of esophageal squamous cell carcinoma in an endemic region:a population-based case control study in Huaian，China〔J〕.BMC Cancer，2006，6(1):287.

［17］ 吴礼高，陶仪声，郑宏波，等.食管鳞癌组织中幽门螺旋杆菌L型和线粒体DNA微卫星不稳定的检测及意义〔J〕.中国肿瘤临床，2008，35(15):864.

［18］ 李小东，林 鹏，龙 浩，等.中国南方食管鳞癌 D5S107和D5S408杂合性丢失与微卫星不稳定性〔J〕.中山大学学报，2008，29(2):135.

［19］ SHENG Jian qiu，CHEN Xiang yu，SUN Zi qin，et al.Microsatellite instability and novelmismatch repair genemutations in northern Chinese population with hereditary nonpolyposis colorectal cancer〔J〕.Chin JGastroenterol Hepatol，2008，4(17):287.

［20］ Vallbohmer D，Peters JH，Kuramochi H，et al.Molecular determinants in Targeted Therapy for Esophageal Adenocarcinoma〔J〕.Arch Surg，2006，141(5):476.

［21］ Hseu YC，Chen SC，Tsai PC，et al.Inhibition of cyclooxygenase-2 and induction of apoptosis in estrogen-nonresponsive breast cancer cells by Antrodia camphorata〔J〕.Food Chem Toxicol，2007，45(7):1107.

［22］ Lee TL，Leung WK，Lau JYW，et al.Inverse association between cyclooxygenase-2 overexpression and microsatellite instability in gastric cancer〔J〕.Cancer Lett，2001，168(2):133.

［23］ WEIJin yin，HAN Cai li，SONGWeiqing，et al.Expressions of COX-2、hMLHl and hMSH2 inmicrosatellite instable colorectal cancer〔J〕.JClin Exp Pathol，2006，22(5):571.

［24］ 王宏霞，陈春华，苏秀兰.食管癌组织中环氧化酶一2的表达与微卫星不稳定的关系及意义〔J〕.内蒙古医学院学报，2010，32(1):28.

［25］ Oda S，Maehara Y，Ikeda Y，et al.Twomodes ofmicrosatellite instability in human cancer:differential connection of defective DNA mismatch repair to dinucleotide repeat instability〔J〕.Nucleic Acids Res，2005，33(5):1628.