α-淀粉酶发酵生产影响因素的研究进展

王绍辉，崔志峰

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶发酵生产影响因素的研究进展

王绍辉，崔志峰*

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶作为一种重要的工业酶制剂，在工业生产中应用十分广泛。对近年来报道的有关温度、pH、碳氮源、金属离子、微量元素、溶氧、发酵工艺等影响α-淀粉酶发酵生产的各种因素进行了综述，旨在为指导α-淀粉酶的工业生产和进一步提高生产效率提供参考。

α-淀粉酶，碳氮源，金属离子，微量元素，发酵工艺

1 培养基成分对发酵生产的影响

1.1 碳氮源对发酵生产的影响

在α-淀粉酶发酵生产中常用的碳源为可溶性淀粉或生淀粉，常用的氮源有酵母提取物、大豆粉、肉汁提取物、蛋白胨等。但是，从工业能耗和生产成本考虑，越来越多的生产厂家开始用一些低成本又能提供良好碳氮源的农业废料如麸皮、油饼来替代成本较高的可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨等精细碳氮源。尽管麸皮等残料在颗粒大小、碳氮比例上参差不齐，同时这类残料含有一些未知的杂质，然而这些替代品不但能提供丰富的营养，而且成本十分低廉，经过研究和优化可以成为良好的碳氮源。

利用低成本的农业原料将是以后大规模发酵生产的趋势。Saban［5］等研究 Bacillus amyloliquefaciens NRRL-645利用蓖麻油饼发酵生产α-淀粉酶时，用响应面法对固体发酵过程中蓖麻油饼、蛋白胨、酵母提取物和(NH4)2SO4进行了优化，当蓖麻油饼、蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2SO4的含量分别为22.62、5.20、1.62、6.81g/L时，α-淀粉酶产量可达到最高为4895U;而在实际培养中产量达到了4827U，与优化前相比提高了8%。

Rajagopalan［6］等以农业废料作为碳氮源，利用一株枯草芽孢杆菌KCC103进行α-淀粉酶的深层液体发酵生产。实验首先对一系列可以作为碳源的麦麸、甘蔗渣、米糠和麦杆等农业废料作了调查，发现利用麦麸生产α-淀粉酶产量最高，这与麦麸含有大量的碳水化合物和蛋白质有关。实验还对适合作为氮源的太阳花油饼、蓖麻油饼、棉籽油饼、芝麻油饼和花生油饼进行了分析，其中太阳花油饼最适合枯草芽孢杆菌KCC103进行α-淀粉酶生产。实验将麦麸和太阳花油饼以1∶1进行混合发酵得到了较高的α-淀粉酶产量(90U/mL)。根据响应面法对培养基进行优化后产量进一步提高，当将麦麸和太阳花油饼以1.27%和1.42%进行混合发酵时，产量比原来提高了14倍，达到1258U/mL。

在固态发酵生产α-淀粉酶时，麸皮作为廉价的农业加工产品的废弃物是十分常用的替代碳源。刘仲敏［7］等在研究米曲霉ZLF13固态发酵时发现麸皮中淀粉的含量会影响到最终α-淀粉酶的产量。在培养基灭菌后，淀粉含量少的麸皮不易粘成团，有利于通气，但是碳氮比较低;而淀粉含量过高的麸皮灭菌后易粘成团，影响通气性，而且粘团内部的淀粉也不利于菌丝的利用吸收。通过实验发现，出粉率在60%左右的麸皮最适合用于米曲霉ZLF13生产α-淀粉酶，在这种生产条件下得到的α-淀粉酶的酶活最高，在中试中平均酶活可达到1283U/g。

1.2 金属离子和其他无机离子对发酵生产的影响

α-淀粉酶是一种金属酶，在发酵过程中适当地加入一些金属离子对于α-淀粉酶的产量有一定的促进作用。Gupta等曾对一些金属离子的影响作过综述，常见的金属离子如K+、Fe2+、Mo2+、Cl-等对于α-淀粉酶的产量基本没有影响;Mg2+则对产量起着关键的作用，在没有添加Mg2+的情况下产酶量会下降50%;Mn2+对于产量也会有一定的促进作用;而Co2+可以使菌体量大大增加但是会导致产量有一定的下降［8］。Dhanya［9］等用 Box-Behnken理论对Bacillus amyloliquefaciens利用麦麸和花生油饼深层液体发酵生产α-淀粉酶进行优化时发现，培养时间和CaCl2浓度对发酵结果起决定作用。当培养时间和CaCl2浓度分别为42h和0.0275mol/L时产酶量达到最高。其他无机离子对于α-淀粉酶发酵生产也有影响，如Ueno等［10］发现在利用Aspergillus oryzae生产α-淀粉酶过程中磷酸盐对于初期的产酶和后续的次级代谢有十分重要的调控作用，研究发现，在磷酸盐的浓度超过0.2mol/L时菌体数和酶的产量都有提高，而低于这个浓度时细胞密度和产酶量都有明显下降，但是在高浓度的磷酸盐培养基中，产酶量严重下降。

1.3 生长因子对发酵生产的影响

Rajagopalan［11］等在研究利用 Bacillus subtilis KCC103进行发酵生产时发现一些微量的生长因子对于产量有着重要的影响。有些氨基酸如组氨酸、缬氨酸、赖氨酸和酪氨酸对酶的产量起阻碍作用，而添加了0.03%的半胱氨酸后，产量增加了2倍。B族维生素添加到培养基后产量也有明显提高，影响最大的是维生素B1和B6，当添加0.02%的维生素B1后，产量提高2.35倍。一些表面活性剂对产量也有一定的影响，如SDS对产量起促进作用，而其他的表面活性剂如吐温20、吐温-80等都对产量起阻碍作用。他们对上述因子进行了优化，在3%生土豆、2%酵母提取物、0.03%半胱氨酸、0.02%维生素 B1、0.02%SDS和0.5mmol/L MgSO4培养基中，36～48h后酶活最大为 537.7U/mL。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生产酸性α-淀粉酶的影响因素时发现，除了底物浓度和pH对酶产量的影响外，酪蛋白和MgSO4对于α-淀粉酶产量也有明显的影响，在0.125%MgSO4和1.5%酪蛋白条件下，酶产量最高。

2 发酵条件的影响

2.1 温度的影响

温度在微生物的生长和代谢过程中起着至关重要的作用。一般用于工业生产α-淀粉酶的菌株多为丝状真菌和芽孢杆菌。多数生产α-淀粉酶的丝状真菌最佳生长温度为25～37℃，一些生产耐高温α-淀 粉 酶 的 真 菌，如 Talaromycesemersonii、Thermomonspora fusca和 Thermomyces lanuginosus等最适温度在50～55℃;生产α-淀粉酶的芽孢杆菌，如Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和Bacillus stearothermophilus的最适生长温度在37～60℃，一些产超耐热α-淀粉酶的细菌如Thermococcus profundus和 Thermatoga maritima的最佳生长温度是 80℃［1］。一株工 程菌 Bacillus licheniformis NH1的最适温度在37℃［13］，在一些产特殊性质α-淀粉酶的细菌中，它们对温度的要求更加苛刻，如一株产耐冷α-淀粉酶的细菌的最适温度为4℃［8］。

2.2 pH的影响

pH在生产过程中是十分重要的参数。而且随着发酵的进行，一些代谢物的释放会改变最初的生长pH，这种变化同时也会对产物的稳定性造成一定影响。通常真菌喜欢偏酸性的生产环境，而细菌在中性环境下生长较好。经研究发现一些曲霉属的真菌如 Asperjillus oryzae、Asperjillus ficuum、和 Asperjillus niger在液体深层发酵过程中，当 pH在5.0～6.0时α-淀粉酶产量最高［14-16］。而细菌如Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和 Bacillus stearothermophilus需要的起始pH为7.0［1］。一些产耐酸性α-淀粉酶的细菌则需要在一个相对偏酸性的环境下才能达到最大产量，如Thermococcus profundus在pH4.5时产酶量最高［17］。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生产酸性α-淀粉酶的影响因素时发现，pH4.0时酶产量最高。

2.3 溶氧的影响

在一些耐高温α-淀粉酶的生产过程中，生产菌株在对数期时强烈需氧，这一时期的供氧量成为菌体生长的限制性因子，对于后来的产酶量有直接影响。林剑［18］等通过对一株α-淀粉酶生产菌株IIY-1液体发酵的研究发现，在对数期需要大量的溶氧，过了对数期后对氧气的需求仍较大，保证对数期后的产酶阶段溶氧不低于10%对于该菌株的耐高温α-淀粉酶发酵顺利进行仍然是很重要的。在固态发酵中，Rahardjo等通过研究A.oryzae CBS570.64在低溶氧情况下的生长状态发现，当溶氧在1%时，菌丝生长缓慢，当降至0.25%时，菌丝的生长明显受限，同时发酵产物的产量严重下降;当溶氧升至21%时，菌丝生长迅速且发酵产物量也大大增加［19］。

3 结论与展望

α-淀粉酶在工业生产中应用十分广泛。随着人类对工业能耗的关注和重视，采用低廉的生物加工废料和高效的加工工艺将是今后生产α-淀粉酶的首选方法。但是，α-淀粉酶发酵生产的影响因素很多，尤其是利用低廉的生物加工废料进行生产时影响因素更加复杂。除此之外，接种方式、生产工艺流程等也会对产量有很大影响。尹源明等［20］通过添加氧载体正十二烷提高发酵体系的氧气传递速率从而促进了发酵体系的产酶能力。在批量生产过程中接种的方式对结果也有很大的影响，Tari和Milner［21］等研究发现两步接种法比一步法的产酶量要高。细胞的固定化技术也被应用于α-淀粉酶的生产过程中，Konsoula［22］等将2%海藻酸钙和3.5%CaCl2用于包埋地衣芽孢杆菌进行α-淀粉酶的固定化生产，使产酶量提高了176%。因此，α-淀粉酶发酵生产的影响因素与酶产量之间有直接关系。对α-淀粉酶发酵生产的影响因素进行研究和优化，有利于进一步降低α-淀粉酶发酵生产成本，提高生产效率，促进α-淀粉酶发酵工业的发展。

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Research progress in influencing factors of fermentation conditions of α-amylase

WANG Shao-hui，CUI Zhi-feng*
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China)

α-amylase has a broad spectrum of industrial applications as an industrial enzyme.In this review，factors that influence fermentation of α-amylase including temperature，pH，mental ions，trace elements，nitrogen and carbon sources，concentration of dissolved oxygen and fermentation process were summarized.

α-amylase;carbon and nitrogen sources;mental ions;trace elements;fermentation process

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0456-03

α-淀粉酶的系统命名为α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，是重要的工业酶制剂，可以随机切断直链淀粉或支链淀粉中相邻的α-1，4-糖苷键、将淀粉水解为糊精和一系列以葡萄糖为组成单位的低聚糖［1］。α-淀粉酶最早在 1811年由Kirchhoff发现，它广泛分布于微生物、植物和动物，但淀粉酶生产菌株主要来源于真菌和细菌，如Asperjillus aryzae、Bacillus subtilis、Bacilluss licheniformis等［2］。α-淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于酒精酿造、淀粉深加工、焙烤工业、啤酒酿造、纺织和医药工业［3-4］。由于利用α-淀粉酶进行工业生产可以缩短生产周期、提高产品得率和原料利用率、减少能耗，越来越引起人们的关注。目前，工业上生产α-淀粉酶主要是通过微生物发酵的方法，其中可以分为固态发酵(SSF)和深层液体发酵(SmF)。固体发酵是一种培养基呈固态、利用自然底物作为碳氮源的发酵方法，对设备的要求较低。深层液体发酵相比于固体发酵方法有许多优点:先进的生产工艺，大大提高了底物的利用率;生产周期短，质量稳定;机械化生产，提高了劳动生产率。在工业生产中，发酵条件对α-淀粉酶产量有重要的影响。本文通过对近年来α-淀粉酶生产中的各种影响因素及优化的研究成果进行综述，旨在为进一步提高α-淀粉酶生产效率提供参考。

2010-02-08 *通讯联系人

王绍辉(1985-)，男，硕士研究生，研究方向:生物技术。