食用真菌喂养大鼠血浆抗氧化活性的测定

辽宁卫生职业技术学院生物技术系(110101) 张中林 郑剑玲 齐 贺

辽 宁 中 医 药 大 学 孙宏伟

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)是两种重要的生物氧化保护酶。SOD有铜-锌-SOD、锰-SOD和铁-SOD3种。它是清除和抗氧化最重要的金属酶[1]。SOD能将组织细胞中的氧自由基通过歧化反应生成过氧化氢和氧分子,从而减少氧自由基对细胞的损伤;GSH-Px是细胞内抗脂质过氧化的酶活性保护系统中的重要成员之一,对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。近年来,一些学者开始合成或从天然植物中寻找具有清除氧自由基效能的有效成分,已取得很大的进展[2]。国内已有关于真菌菌丝及子实体中 SOD检测的报道[3-4]。本实验以新鲜的食用真菌为材料,喂养大鼠观察其血浆中 SOD和 GSH-Px活性改变。

1 材 料

1.1 动物和样品 选取成年大鼠 36只,体重为 190～240g,由辽宁中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号：SCXK(京)2004-0001,随机分为 3组,分别为香菇真菌组、金针菇真菌组及对照组,每组各12只,雌雄各半,分圈饲养,饮去离子水,自由进食。香菇真菌粉和金针菇真菌粉由辽宁省农科院食用真菌研究所提供。实验时分别称取样品各 5g,用纯净水配成 50m L的样液,每只灌胃 4m L/100g体重给受试动物。每周称重,给样量根据每周体重增减调整,实验时间为 40天。

1.2 药物与试剂 邻苯三酚：白色粉末,瓯海化工试剂厂。无水乙醇：分析纯,沈阳第一试剂厂。氯仿：分析纯,天津化学试剂厂。50mmol/L Tris-HCL缓冲液pH 8.0。还原型谷胱甘肽(GSH)：上海化学试剂厂。 H2O2：天津市化工厂。5,5'-二巯基-2,2'-二硝基苯甲酸(DTNB)：黄色粉末,英国。

1.3 仪器 自动记录分光光度计(日本 Shimadzu,UV-265)。离心机(北京医用离心机厂,LD4-2A)。电热恒温三用水箱(北京永光明医疗仪器)。

2 方 法

2.1 制备血浆 称体重,用 1%戊巴比妥进行腹腔麻醉(0.4m L/100g体重),开腹,腹主动脉采血,肝素抗凝,4℃冷藏。

2.2 血浆超氧化物歧化酶活性的测定

2.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定 SOD活性(Marland法 )[5],取 3m L的 50mmol/L Tris-HCL,pH 8.0缓冲液做空白,用 UV-265岛津自动记录分光光度计,调零点,再取 3mL缓冲液加入邻苯三酚,迅速混匀,然后快速倒入 1cm紫外比色杯中,25℃恒温池中,波长为 325 nm,在 2分钟内连续测定其光密度值变化。计算线性范围内每分钟光密度值的增加(△A),即为邻苯三酚自氧化速率(△A0)。

2.2.2 样品血浆 SOD活性的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定酶活性。分别取 200μL血浆,加 200μL蒸馏水,振混 1分钟后加 100μL冷无水乙醇,再振混 1分钟,然后加 100μL氯仿,振混 1分钟后,以3000 rpm/min,离心 10分钟,上清备用。测试须先加入待测血浆于适量缓冲液中,混匀后,再加入邻苯三酚,迅速混匀,然后快速倒入 1cm紫外比色杯中,25℃恒温池中,波长为 325nm,在 2分钟内连续测定其光密度值变化。

2.2.3 样品酶活性的计算 在温度25℃,pH 8.0的条件下,检测波长为 325nm,每 1m L反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%的酶量,定义为1个酶活力单位 U。

其原理：邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出 O2-,SOD能催化发生歧化反应,生成 H2O2和 O2,从而抑制邻苯三酚的自氧化,反应如下：2+2H→H2O2+O2样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率,即反映样品中 SOD的含量。

2.3 GSH-Px酶活性测定 GSH-Px活性 (DTNB法[6],测定管取 GSH与上清液各 0.4mL,空白管以pH7.0磷酸缓冲液 0.4mL代替 GSH溶液。并以水代替真菌发酵液做非酶管。各管均置于 37℃预温5分钟,然后加入已预温至 37℃的 H2O2溶液0.2m L,混匀并立即记录反应开始时间,继续保温 5分钟,反应完毕后,立即依次加入偏磷酸沉淀液4.0m L,使蛋白酶失活。以 3000 rpm/m in,离心 10分钟,取出上清液 2m L,加入 Na2HPO4淀液 2mL,与DTNB试剂1.0mL混匀,迅速用 UV-265岛津自动记录分光光度计,412nm光波处测定光密度值。酶活力单位定义为：在温度 37℃,规定 0.4mL上清液,每分钟扣除非酶反应的 Log[GSH]降低 1为一个酶活力单位(U)。

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析处理,计量资料以(±s)表示,组间比较用单因素方差分析,P＜0.05为差异有显著性。

3 结 果

3组大鼠血浆中 SOD活性与 GSH-Px活性的改变(其中 7只大鼠自然死亡)。见表 1。

表1 不同食用真菌喂养大鼠血浆中SOD活性与GSH-Px活性的改变

香菇真菌喂养大鼠血浆中 SOD活性水平高于正常对照组,差异有显著性(P＜0.05)。金针菇真菌喂养大鼠血浆中 SOD活性水平高于正常对照组,差异有显著性(P＜0.05)。香菇真菌和金针菇真菌喂养大鼠血浆中 SOD活性差异无显著性(P＞0.05)。

香菇真菌和金针菇真菌喂养大鼠血浆中 GSHPx酶活性与正常对照组,差异无显著性(P＞0.05)。但 GSH-Px酶活性也有增加趋势。

4 讨 论

食用真菌类一般都是高等真菌的子实体,日常食用的有香菇真菌、金针菇真菌等多种。这些食用真菌不仅营养丰富,而且一直以其特有的食药兼用性受到人们的青睐。国内外学者对多种来源的SOD作了大量的研究,其开发应用越来越受到重视[7]。GSH-Px在细胞抗氧化防御机制中的作用逐步受到人们关注[8]。

本次实验用香菇真菌和金针菇真菌喂养大鼠,血浆中 SOD活性水平均高于正常对照组,差异有显著性(P＜0.05)。香菇真菌和金针菇真菌喂养大鼠血浆中SOD活性水平差异无显著性(P＞0.05)。香菇真菌、金针菇真菌喂养大鼠后,血浆中 SOD活性水平显著提高,GSH-Px酶活性也有增加趋势。目前可利用的 SOD资源主要为动物血液、细菌、高等植物以及微生物发酵产物。其中真菌以酵母菌为主,但酵母菌的去壁环节给工业化生产 SOD带来一定困难。食用真菌比细菌或其它工程菌发酵生产SOD更易通过毒理实验,而且不必在所有产品中严格分离菌丝与发酵液。

SOD是重要的生物氧化保护酶之一。其活力的提高,有益于机体抗氧化能力的提高,它能使 O-2进一步生成 H2O2,而 GSH-Px则能使 H2O2迅速清除,两者联合作用可有效防止组织细胞受到氧化损伤[9]。SOD是人体抗氧化机制中的重要成分,尤其表现为对氧自由基的排除上。SOD通过其优先被氧化,或修复氧化引起的损伤,从而对机体起到保护作用。实验研究表明,氧自由基与人体衰老及多种疾病如冠心病、高血压、老年痴呆、癌症、白内障等疾病有密切的联系。抑制和清除氧自由基能延缓人体衰老和死亡,因此防御氧自由基对人体的健康损害有重要的现实意义。人们应适量增加香菇和金针菇等食用真菌的摄入,因为食用真菌富含抗氧化营养素 SOD。目前,对 SOD资源的开发利用也是国内外许多生物技术开发中心的重点药剂开发项目。本次实验为食用真菌中的 SOD、GSH-Px开发利用资源提供实验依据。

[1] Mecord JMI,Fridovich.Superoxide dismutase an enzym ic function for erythrocuprein(hernocoprein)[J].J Biol Chem,1969,244：6049

[2] 刘凤书,侯开卫,李绍家,等 .余甘子果汁超氧化物歧化酶的研究[J].热带作物学报,1992,13(2)：37

[3] 陆玲,潘欣,袁生.金针菇液体培养菌丝与子实体 SOD特性比较研究[J].中国食用菌,1999,18(5)：25

[4] 郭建春,王宇光,胡新文.几种珍贵食用和药用真菌超氧化物歧化酶 (SOD)的研究[J].热带作物学报,1995,增刊

[5] MARLAND S,MARKLUNDd G.Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogollol and a convenient assay for superoxide dismutase[J].Eur JBiochem,1974,47∶469

[6] HAFEMEN D G.Effect of dietary selenium on erythrocyte and liver glutathione peroxidase in the rats[J].JNutr,1974,104(5)∶580

[7] 方允中,李文杰 .自由基与酶[M].北京：科学出版社,1989：71

[8] 杨冬华,刘为纹.谷胱甘肽过氧化物酶与肝脏疾病[J].国外医学.消化系疾病分册,1988,3(3)：139

[9] 崔旭 .D-半乳糖脑老化模型的脂质过氧化机理[J].中国老年学杂志,1998,18(1)：38