低值鱼肉蛋白酶解工艺研究

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州434025）

近年来，我国水产生产持续稳定发展，已成为世界第一渔业大国。随着养殖规模的不断扩张，产量大幅度提高，水产品加工的地位已显得日益重要。随着人们生活水平的提高，低值鱼类直接食用的价值越来越低[1]。目前，低值鱼深加工仍是个薄弱环节。除冷冻外运外，精加工尚处于起步待开发阶段[2-3]。对低值鱼蛋白进行水解得到的水解蛋白，含有大量的肽类和氨基酸，不仅具有独特的风味，而且还有许多生理活性，在调味品和营养保健等方面都有很广泛的应用[4-5]。本研究以翘嘴红鲌(Hemiculterlcucisculus）为对象，探讨了鱼肉酶解工艺，试图为低值鱼的深加工探索一条出路。

1 材料与方法

1．1 材料

翘嘴红鲌采购于长江大学农贸市场。测定小翘嘴红鲌的基本组成为：蛋白质15．74g／100g、粗脂肪4．60g／100g、水分72．39g／100g和灰分0．98g／100g。

中性蛋白酶(60000U／g）、碱性蛋白酶(10000U／g）、木瓜蛋白酶(500000U／g）、茚三酮、乙酸、乙酸钠、盐酸、氢氧化钠、考马斯亮蓝G-250、无水乙醚均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司生产；牛血清、抗坏血酸、亮氨酸均为分析纯，天津市百世化工有限公司生产。

HH-4数控恒温水浴锅、离心机为常州圆华电器有限公司生产；UV-1800紫外可见分光光度计为上海美谱达仪器有限公司生产；101A-3型电热鼓风干燥箱为武汉教学仪器总厂生产；PL303 1／1000电子天平为梅特勒托利多仪器(上海）有限公司生产。

1．2 方法

将翘嘴红鲌经去头、去尾、去内脏、去鱼鳞的预处理，清洗，沥干水分，绞碎成鱼肉。

采用常压干燥法GB-64351986测定鱼肉水分、高温灼烧法GB／T5009．4-1985测定鱼肉总灰分、索氏抽提法GB／T5512-1985测定鱼肉粗脂肪、考马斯亮蓝G-250染色法测定鱼肉蛋白质。

称取一定量绞碎的鱼肉，按比例加入适量的蒸馏水，用2mol／L的NaOH或HCl调节至合适的pH，恒温水浴一定时间，水解结束后沸水浴灭酶10min，于4000r／min离心10min，上清液即酶解液。

水解液中的游离氨基态氮含量采用茚三酮法，以亮氨酸为标准品在520nm处比色测定光密度。标准样品测定后经回归处理得到氨基酸含量(x，μg／mL）与光密度(y）的直线回归方程为：y＝0．1348x-1．0714×10-4（R2＝0．9993）。根据此直线回归方程计算水解液中的游离氨基态氮含量，再按下式计算水解度：水解度(%）＝(上清液中的游离氨基态氮含量／原料中总蛋白质含量）×100%。

通过单因素试验考察中性蛋白酶(温度50℃、pH 7．0）、碱性蛋白酶(温度50℃、pH 9．0）、木瓜蛋白酶(温度50℃、pH 7．0）3种酶的反应条件对翘嘴红鲌肉蛋白水解度的影响，通过正交试验优化其水解条件。

单因素试验条件：（1）在加酶量2400U／g，温度50℃，时间2h，料液比1∶5条件下，考察pH分别为5、6、7、8、9、10时对翘嘴红鲌肉蛋白水解度的影响。（2）在温度50℃，时间2h，料液比1∶5、pH为7（碱性蛋白酶为9）条件下，考察加酶量分别为1200、2400、3600、4800、6000U／g时对翘嘴红鲌肉蛋白水解度的影响。（3）在加酶量2400U／g，温度50℃，时间2h，pH为7（碱性蛋白酶为9）条件下，考察料液比分别为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7时对翘嘴红鲌肉蛋白水解度的影响。（4）在加酶量2400U／g，时间2h，料液比1∶5、pH为7（碱性蛋白酶为9）条件下，考察水解温度分别为40、45、50、55、60℃时对翘嘴红鲌肉蛋白水解度的影响。（5）在加酶量2400U／g，温度50℃，料液比1∶5、pH为7（碱性蛋白酶为9）条件下，考察水解时间分别为1、2、4、6、8h时对翘嘴红鲌肉蛋白水解度的影响。

在单因素试验的基础上，以水解度为试验指标，以pH、加酶量、料液比、水解温度和水解时间为因素，通过L16（45）正交设计优化3种酶的水解条件。

2 结果与分析

2．1 pH对水解度的影响

图1 不同pH条件下翘嘴红鲌肉蛋白的水解度

2．2 加酶量对水解度的影响

图1是3种酶在温度50℃、料液比1∶5、加酶量2400U／g、不同pH条件下水解2h，沸水浴灭酶后测得的水解度结果。

对环境酸碱度敏感是酶的特点之一，每一种酶只能在一定pH条件下才表现出其最大的酶活性。各种酶的最适pH都不同。过酸或过碱都会影响酶蛋白的构象，甚至导致酶变性失活[5]。由图1可知，随着pH的增加，3种酶的水解度呈先上升后下降的趋势。中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适pH 分别为7．0、9．0、7．0。

中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶在各自适宜的pH和反应温度50℃、相同的料液比1∶5，不同的加酶量条件下水解小翘嘴红鲌肉蛋白2h，图2为测得的水解度结果。

由图2可知，随着酶用量的增加，3种酶的水解度值逐渐上升，但当加酶量达到一定量时，水解度值反而减小。加酶量过大时，能与酶反应的底物的位点不足，酶出现过量的现象。因此可以确定3种酶的适宜添加量分别为3600、3600、4800U／g。

图2 不同加酶量下翘嘴红鲌肉蛋白的水解度

2．3 料液比对水解度的影响

在加酶量为2400U／g、温度50℃，各种酶在各自适宜pH，不同料液比条件下水解2h后沸水浴灭酶，测得其水解度结果如图3。

由图3可知，随着溶剂的增多，水解度呈先上升后下降趋势。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最适料液比为1∶4，碱性蛋白酶最适料液比为1∶5。

2．4 水解温度对水解度的影响

中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶加酶量均为2400U／g、料液比为1∶5，在各自适宜pH，不同温度条件下水解2h，沸水浴灭酶后测得其水解度结果如图4。

从图4可知，水解度呈先上升后下降趋势。在低于最适温度时，水解度随温度升高而上升；当高于最适温度时，酶活性有一定程度丧失，导致水解度下降。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最适温度为50℃，碱性蛋白酶的最适温度为45℃。

图3 不同料液比下翘嘴红鲌肉蛋白的水解度

2．6 水解时间对水解度的影响

3种酶在各自适宜的条件下，水解不同的时间，水解度结果如图5。从图5可知，随着水解时间的延长，水解度不断升高，中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适水解时间分别为6h、8h、6h。

图4 不同水解温度下翘嘴红鲌肉蛋白的水解度

图5 不同水解时间下翘嘴红鲌肉蛋白的水解度

2．6 正交试验结果

根据单因素试验结果，以水解度为试验指标进行正交试验，选取L16（45）正交表，因素水平设置如表1所示。

表1 正交试验因素水平

正交试验结果分析如表2所示。由表2可知，中性蛋白酶水解翘嘴红鲌肉蛋白的主次因素是pH＞温度＞料液比＞加酶量＞时间。即pH因素影响最大，温度因素次之，而后是料液比因素，加酶量因素影响较小，时间因素的影响最小。根据正交试验结果，初步确定中性蛋白酶的最佳水解工艺参数为：最适温度为50℃，最适时间为8h，最适加酶量为3600U／g，最适料液比是1∶4，最适pH 7．0。

碱性蛋白酶水解翘嘴红鲌肉蛋白的主次因素是时间＞温度＞pH＞料液比＞加酶量。即时间因素影响最大，温度因素次之，而后是pH因素，料液比因素影响较小，加酶量因素的影响最小。根据正交试验结果，初步确定碱性蛋白酶的最佳水解工艺参数为：最适温度为45℃，最适时间为8h，最适加酶量为3600U／g，最适料液比是1∶5，最适pH 9．0。

表2 正交试验结果

木瓜蛋白酶水解小翘嘴红鲌肉蛋白的主次因素是pH＞温度＞加酶量＞料液比＞时间。即pH因素影响最大，温度因素次之，而后是加酶量因素，料液比因素影响较小，时间因素的影响最小。根据正交试验结果，初步确定木瓜蛋白酶的最佳水解工艺参数为：最适温度为50℃，最适时间为8h，最适加酶量为4800U／g，最适料液比是1∶4，最适pH 6．5。

在单因素试验和正交试验的基础上，根据所得的最佳水平组合做验证试验。中性蛋白酶在最佳水平组合条件下，水解度达到13．64%；碱性蛋白酶达到21．27%；木瓜蛋白酶达到16．42%。采用最佳水平组合后，其水解度大有提高。

3 结论

鱼蛋白经水解作用后，其功能和品质可得到更大的提高，所以，酶水解法为低值鱼深加工提供了一条有效的途径。本研究以翘嘴红鲌为低值鱼代表，得出了其鱼肉3种酶类酶解工艺。具体为中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶最适水解条件分别是温度50、45、50℃，时间8、8、8h，加酶量3600、3600、4800U／g，料液比1∶4、1∶5、1∶4，和pH 7．0、9．0、6．5。

[1]赵占西．我国淡水水产品加工业的现状和前景展望 [J]．河海大学常州分校学报，2001，24（12）：30-37．

[2]戴新明，熊善柏．湖北省淡水鱼加工与综合利用 [J]．渔业现代化，2004，8（3）：14-17．

[3]光翠娥，黄 敏．加强淡水鱼的加工与综合利用 [J]．食品研究与开发，2005，32（3）：25-27．

[4]孔繁东，任雪娇，祖国仁，等．低值鱼调味品的研究进展 [J]．中国酿造，2010，（2）：11-12．

[5]Liaset B，Lied E，Espe M，et al．Enzymatic hydrolysis of by-products from the fish-filleting industry：chemical characterisation and nutritional evaluation[J]．Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80：9-10．