激光共聚焦显微术在中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡研究中的应用

李钻芳 陈文列 陈荣

激光扫描共聚焦显微术(laser scanning confocal microscopy，LSCM)是先进的细胞和分子生物研究技术，是在荧光显微镜的基础上配置激光光源，扫描装置，共聚焦装置和检测系统加以数据化的图像处理技术而形成的新型显微镜技术，因其独特的激光扫描装置，具有不损伤细胞、共焦成像分辨率高、能层析扫描、实现多重荧光共定位以及能观察样品的三维图像等优点，已被广泛应用于形态学、细胞生物学、分子生物学、发育生物学、神经科学、药理学、遗传学和环境科学以及抗肿瘤药物研究等领域。

1 LSCM在肿瘤细胞凋亡检测中的优势

促进肿瘤细胞凋亡是许多中药杀伤肿瘤细胞的重要途径，中药诱导细胞凋亡成为中医药抗肿瘤机制的研究热点之一。细胞凋亡时伴随染色质的降解及凋亡相关信号的传递，中药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而促进细胞凋亡，维持机体内平衡，延缓或阻止组织病理过程的恶化。

细胞凋亡的常用检测有形态学的光学显微镜、电子显微镜观察，生物化学的DNA凝胶电泳法，流式细胞术等方法，但各自都有一定的局限性，如电镜观察制样程序费时、不易定量，流式细胞术检测的是群体细胞或某一类细胞的各凋亡指标，无法对单个细胞进行定位分析，无法确定凋亡位点。而激光扫描共聚焦显微术，通过结合各种特异性荧光探针，不仅能实现核酸、蛋白质、抗体、受体等大分子的定位、定性、定时及定量检测，还能从分子水平检测到单细胞在活性状态下的各指标信号，在观察细胞形态、检测凋亡进程及测定活细胞凋亡过程中钙离子、线粒体膜电位、活性氧自由基变化等方面得到广泛应用。

2 LSCM在中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡研究中的应用

2.1 观察细胞核变化与凋亡小体

经特异性的DNA、RNA荧光探针(如吖啶橙AO、碘化丙啶PI)或DNA荧光探针(如Hoechst33258、Hoechst33342、DAPI)等标记后的细胞，用LSCM能获得其细胞核清晰的图像，能直观地显示细胞受损后DNA和RNA的变化，在凋亡细胞的LSCM图像上可见细胞核染色质浓缩、DNA凝结而成的凋亡小体等；而AO或PI还可显出细胞轮廓、凋亡细胞出芽等。不同于电镜下观察，LSCM能够在保持细胞活性及完整性的前提下，对细胞进行观察和测量，其图像质量好、分辨率高，可以实现多重荧光信号共同观察，甚至可以获得细胞三维重建图像。此外，通过结合显示凋亡早期细胞膜变化的灵敏指标Annexin V，可准确定位与定量观察细胞膜与细胞核的凋亡位点。

王学习[1]、季宇彬[2,3]、高世勇[4]、周炳刚[5]等分别应用LSCM结合AO荧光探针单标法或AO/EB双染法，研究扶正抑瘤颗粒含药血清、龙葵碱、甘草黄酮、苦参碱对荷瘤小鼠H22肝癌细胞及S180肿瘤细胞或肝癌细胞HepG2、人乳腺癌MCF-7/ADR细胞的DNA 、RNA含量或细胞核的变化，以及三维DNA荧光强度分布[5]，结果表明这些中药、天然药及其提取物可破坏肿瘤细胞核酸，降低DNA/RNA比值，抑制核酸复制与合成而抑制细胞的生长，甚至出现凋亡小体等典型的凋亡形态学特征。

韩健等[6]、焦鹏等[7]用LSCM结合Annexin V/FITC或Annexin V/PI双染法，观察临床抗癌中药冬凌草甲素、白花丹参根制剂对人胃癌细胞BGC-823的抑制增殖或诱导凋亡的作用。杨洋等[8]观察PI荧光标记细胞核变化，研究槲皮素联合顺铂对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡影响，结果见细胞核收缩、凝集、碎裂等凋亡现象。周欣阳等[9]应用FITC荧光素标记天花粉蛋白(TCS)，在LSCM下直接观察TCS进入黑色素瘤B16细胞动态过程，发现TCS能抑制黑色素瘤细胞活性、抑制分裂增殖，且诱导细胞凋亡，出现凋亡小体。

柯文娟等[10]利用LSCM结合Hoechst33258染色，研究甘草次酸对髓系白血病细胞系K562 的抗癌机制，观察到甘草次酸能诱导细胞凋亡、产生凋亡小体而抑制其增殖。张春阳等[11]、周欣阳[9]应用LSCM包括双光子激发激光扫描显微术结合Hoechst33258染色，观察到TCS作用人绒癌细胞(JAR)、H22肝癌细胞后，核染色质浓缩，出现凋亡小体等。

2.2 观测细胞内Ca2+浓度

细胞质中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用，细胞核内Ca2+浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。在LCSM出现之前，对Ca2+的研究大都是通过死细胞进行的，无法对细胞内的Ca2+信号进行动态观测，而Ca2+的动态变化是反映细胞生理过程及生理变化的重要信息。结合特异性Ca2+荧光探针Fluo-3/AM、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，LSCM不仅能够精确测定其浓度，还可以在亚细胞水平上对细胞内外Ca2+的活动进行精确的时间和空间上分布，提供其动态变化的图像，实时观测药物作用下细胞内外Ca2+浓度的变化，从而判断药物的抗癌活性、治疗效果等。

季宇彬等[12]、邹翔等[13]、朱丽丽等[14]、孙纪元等[15]、高世勇等[4]、张长城等[16]应用LSCM结合Fluo-3/AM探针分别观察中西药复方抗癌制剂海嘧啶、西兰花中的抗癌活性成分葡萄糖异硫氰酸盐GS、重楼皂苷、苦马豆素、龙葵碱、青蒿琥酯等对人胃腺癌SGC-7901细胞、人前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用，及经各中药、天然药处理的细胞内Ca2+浓度的动态变化，表明上述中药、天然药均能升高Ca2+浓度，影响细胞周期，其凋亡作用机制与细胞内钙超载有关，而海嘧啶则可通过开放细胞膜钙通道和引起细胞内钙释放两条途径诱导肿瘤细胞凋亡。

2.3 观测线粒体膜电位变化

细胞线粒体膜电位(MMP)是细胞能量产生的先决条件，其变化是细胞凋亡的一个早期特征，是细胞凋亡不可逆转的标志。在细胞凋亡过程中，细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏，发生磷脂外酰丝氨酸由内层向外层的翻转，暴露在外面的磷脂酰丝氨酸可以被周围的吞噬细胞识别、吞噬，从而使凋亡的细胞得以被清除[17]。在各种药物刺激下，通过LSCM测量线粒体特异性探针JC-1、Rhodamine123、Annexin V、TMRE等的荧光强度变化，就能反应MMP的变化及线粒体功能状态，不仅可以定量分析，还可对其进行实时动态扫描，获得药物刺激下MMP瞬时动态变化，及时反应药物对细胞凋亡的影响。

代志军等[18]、王学习等[19]、高世勇等[4]用LSCM结合Rhodamine123或TMRE荧光探针研究中药半枝莲提取物(ESB) 含药血清、糙叶败酱提取物、龙葵碱分别作用于肝癌HepG2 、H22细胞及S180细胞后MMP的变化，结果均显示各中药或天然药均可不同程度降低MMP，诱导肿瘤细胞凋亡。

2.4 观测活性氧自由基含量

活性氧自由基(ROS)是诱导细胞凋亡和影响细胞衰老的主要因素之一，正常情况下，它的产生和消除处于平衡状态，过量的ROS 会引起细胞内核酸、蛋白质等生物大分子损伤，引起蛋白质氧化，DNA链断裂，细胞膜起泡、脂质氧化等细胞凋亡特征，从而引发炎症、癌症等疾病。结合特异性荧光探针如DCFH-DA，利用荧光强度与活性氧浓度的线性关系，通过LSCM就能灵敏高效地检测到细胞内ROS含量的变化。

王学习等[1,19]利用LSCM结合D-399探针观察扶正抑瘤颗粒含药血清、糙叶败酱提取物作用于S180细胞后ROS的变化，结果显示提取物持续作用细胞48小时后，高剂量组细胞ROS增加，可能使DNA链断裂，导致细胞凋亡。

2.5 观测细胞凋亡相关基因表达

细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有Bcl-2基因家族、Caspase家族等。采用LSCM结合荧光抗体技术观察相关基因表达，不仅可定位细胞内各相关基因表达位点，还可同时定量每个细胞的荧光强度，间接反映目标蛋白含量，以检测药物对各基因表达的影响。

季宇彬等[20,21]采用LSCM结合FITC染色，进行肝癌HepG2细胞内Caspase-3及Bcl-2的定位，并显示龙葵碱能显著升高细胞内Caspase-3含量，降低Bcl-2含量，诱导细胞凋亡。

邓刚等[22]用LSCM结合免疫荧光细胞化学，研究姜黄素对前列腺癌PC3细胞Notch1蛋白表达和亚细胞定位，显示Notch1定位于胞膜、胞质，且胞核表达增加，呈浓度依赖性，表明姜黄素诱导凋亡可能与Notch1 表达和核易位激活有关。

李祺福等[23,24]用LSCM结合免疫荧光抗体，分别观察到人参皂甙Rg1、肉桂酸、丹参酮组合(RCT)诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中，Nucleophosmin(NPM)及prohibitin在MG-63细胞中，与c-fos、c-myc、RB、p53等基因产物具有共定位关系，并在RCT处理后细胞核内其共定位区域发生了变化。

2.6 观测细胞通讯

某些细胞癌变时，缝隙连接会减少甚至消失，丧失细胞间通讯能力，阻碍细胞间传递控制正常生长的有关信息，这提示肿瘤细胞的快速分裂、增殖和转移, 与缝隙连接的消失有关。通过测量细胞缝隙连接分子的转移，可以研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用。LSCM可采用荧光光漂白恢复(FRAP)技术检测细胞缝隙连接，通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量，来判断细胞缝隙连接的通讯功能。

王学习等[25]应用LSCM结合CFDA-AM荧光探针，按FRAP分析程序，测定荷瘤小鼠H22细胞间通讯状况，结果显示不同剂量组扶正抑瘤颗粒含药血清作用于H22细胞，细胞间荧光恢复速率即细胞间通讯状况均有不同程度的提高。

2.7 其它

LSCM不仅能够对所测对象进行实时显微成像，还能检测样品的自发荧光光谱或新荧光探针的发射光谱，以及在标记过程中造成的荧光探针光谱转移等。利用此光谱扫描功能，可以进一步确定抗肿瘤药物在肿瘤细胞内的分布情况及作用机制。

陈同生等[26,27]采用LSCM成像及荧光共振能量转移( FRET)技术，通过检测细胞形态及活细胞中SCAT3 质粒的荧光光谱，分别研究中药蟾酥、消癌平诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞凋亡过程中Caspase-3的活化特性，结果表明蟾酥能诱导癌细胞凋亡，出现凋亡小体，且Caspase-3参与调控蟾酥诱导的细胞凋亡过程，消癌平有效抑制细胞的增殖活性，并于作用72小时时诱导细胞内Caspase-3的活化。

3 展望

随着激光扫描共聚焦显微镜技术的普及，有关中药抗肿瘤作用机制的研究日渐增多，检测手段也日益先进。在观察细胞凋亡时细胞形态变化、测定细胞内钙离子浓度、活性氧自由基、细胞膜电位等信号的变化以及DNA/RNA、基因蛋白表达、细胞周期等研究中，激光扫描共聚焦显微技术显示出很强的优越性。它不仅可以动态观察药物在细胞中的分布及其干预细胞的变化情况，还可以通过观察不同时间段药物与靶点的结合情况，了解其在细胞内代谢过程，以判断服药的最佳时间，以进一步提高药效。

根据现代药理学研究，抗肿瘤中药主要有两大类，一类是细胞毒药物，一类是具有免疫增强作用、生物反应调节剂样作用的药物。中药抗肿瘤具有多靶点、多效应、不良反应小、不易产生耐药性、安全有效等优点[28]。研究表明，中药是通过多个环节起到抑制恶性肿瘤的作用[29]，目前LSCM技术在抗肿瘤药物作用机制研究中，大部分仅局限于诱导细胞凋亡研究，对中药活性物质在体内变化及作用特点、细胞毒作用、增强机体免疫功能、分子水平上抗肿瘤血管生成、抑制多药耐药、抑制肿瘤细胞侵袭转移等机制研究中还比较少。中药现代化过程中，随着各学科间的发展和相互渗透，激光扫描共聚焦显微技术有着广阔的应用前景，特别是在中药抗肿瘤作用机理的基础研究以及抗肿瘤新药药效研究上，将发挥越来越重要的作用。

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