多壁碳纳米管基质固相分散-高效液相色谱测定牛奶中6种四环素

王学翠，刘 冰，张璐鑫，季晶晶，施金秋，张 航，杨宗惠，吴 宏

(徐州师范大学化学化工学院，江苏省功能材料绿色合成重点实验室，江苏 徐州 221116)

多壁碳纳米管基质固相分散-高效液相色谱测定牛奶中6种四环素

王学翠，刘 冰，张璐鑫，季晶晶，施金秋，张 航，杨宗惠，吴 宏*

(徐州师范大学化学化工学院，江苏省功能材料绿色合成重点实验室，江苏 徐州 221116)

以多壁碳纳米管为吸附材料，建立基质固相分散萃取高效液相色谱法测定牛奶中6种四环素。将多壁碳纳米管、EDTA、草酸和样品研磨混匀装柱，经含甲酸的甲醇洗脱后HPLC多波长紫外检测。6种四环素的检出限0.01～0.03μg/mL，回收率78.7%～105.2%，相对标准偏差小于12%。多壁碳纳米管基质固相分散萃取牛奶中四环素的回收率优于C18，可推广到食品等复杂样品中其他农兽药多残留分析。

四环素；基质固相分散；碳纳米管；高效液相色谱法

四环素类(tetracyclines，TCs)抗生素为广谱抗菌药，对革兰氏阳性和阴性细菌、立克次氏体等均有抑制作用[1]。在预防和治疗畜禽疾病过程中，由于药物不合理使用，可能导致在动物性食品及牛奶中四环素类药物的残留问题[2]。在已报道的四环素类抗生素检测方法中，微生物法一般用于总量测定，酶联免疫法用于个别四环素测定，薄层色谱法用于限量分析[3]，而毛细管电泳法和液相色谱法则用于多种四环素类抗生素同时测定。高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分离结合紫外[4]、二极管阵列[1,5]、荧光[6]、电化学[7]、化学发光[3]和质谱[2,8]检测，是牛奶中四环素类抗生素残留分析的主要手段。

高效液相色谱分析前的样品提取和净化步骤十分重要。与固相萃取技术[9]相比，基质固相分散(matrix solid phase dispersion，MSPD)集样品匀化、提取和净化过程于一体，操作更加简单[10-11]。MSPD常用的吸附剂主要有C18、硅藻土和硅胶，但有些应用的选择性不高[12]。基于新型吸附材料碳纳米管的固相萃取技术在农兽药残留分析中已有一些报道[13-14]，但在MSPD中的应用还很少[15]。本实验旨在建立多壁碳纳米管材料MSPD技术，结合高效液相色谱多波长检测牛奶中6种四环素类抗生素。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸四环素、脱水四环素、盐酸金霉素、土霉素、美他环素和多西环素对照品 中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈(色谱纯) 德国Merck公司；甲酸、柠檬酸、磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸二钠均为分析纯；所用水为重蒸水。

多壁碳纳米管(直径40～60nm，长度5～15μm，纯度≥95%) 深圳纳米港有限公司。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱仪(配置二元泵、自动进样器、多波长紫外检测器及ChemStation工作站) 美国Agilent公司。

1.3 仪器条件

色谱柱：EclipseXDB-C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；流动相：0.01mol/L甲酸(A)-甲醇-乙腈(1∶3，B)；流速0.3mL/min；进样体积20μL；柱温25℃；检测波长355nm；洗脱梯度：0min(20% B)→2min(25% B)→4min (30% B)→6min(35% B)→13min(40.0% B)→14min(60% B)→15.0min(20% B)，共15min。

1.4 标准溶液制备

分别准确称取一定量的6种四环素对照品，用甲醇溶解定容配制成1000μg/mL贮备液。分别吸取适量标准贮备液，配制成10.0μg/mL混合标准溶液，置冰箱避光存放。

1.5 多壁碳纳米管氧化处理

称取2g多壁碳纳米管于圆底蒸馏瓶中，加入100mL浓硝酸，120℃回流1h。冷却后，用蒸馏水洗至中性，烘干后保存备用。

药品质量标准变更后的发布渠道不统一，不同地域的生产企业、药检机构难以及时获取。针对《中国药典》、部（局）颁标准等成册标准和注册标准等单行页标准，在使用过程中发现的问题以及试行标准转正、药品标准修订等，国家药典委员会、国家药监局药品注册管理部门等每年均发布大量的标准勘误、标准修订等信息，尤其是单行页标准的发布，有关部门只将此类标准发送到省级药品监督管理部门和相关生产单位，大多数市（地）级药检机构以及有关药品生产企业，由于信息不畅，无法及时获取，对药品质量标准的执行和药品监管有一定影响。

1.6 MSPD样品处理

称取0.5g氧化的多壁碳纳米管置于玻璃研钵中，分别加入0.05g乙二胺四乙酸二钠和草酸，将2mL牛奶样品加至多壁碳纳米管填料上，轻轻研磨成为均匀的样品混合物。在底部填充玻璃棉的玻璃注射器中，依次加入1.0g硫酸钠、1.5g Florisil硅土、样品混合物和0.5g硫酸钠。压紧填料后，滤纸覆盖。以1mL/min流速，用5mL含0.01mol/L甲酸的甲醇溶液洗脱。氮气吹干洗脱液，用1.0mL流动相溶解残渣，经0.45μm滤膜过滤，供HPLC分析，标准曲线法定量。

2 结果与分析

2.1 检测波长选择

比较6种四环素类抗生素在268、270、355、360nm不同波长处的紫外吸收响应。结果表明：在355nm波长处，盐酸四环素、美他环素、多西环素、土霉素、盐酸金霉素均有较强吸收，且分离效果好，而脱水四环素则出现倒峰；在270nm波长处，脱水四环素有较强吸收，但其余5种四环素吸收不强。综合考虑，选择355nm为5种四环素的检测波长，而270nm为脱水四环素的检测波长。

2.2 流动相选择

文献[2,4,16]报道了HPLC测定四环素类药物的几种流动相组成。本实验考察比较0.01mol/L三氟乙酸-甲醇、0.01mol/L草酸-乙腈和0.01mol/L甲酸(A)-甲醇-乙腈(1∶3，B)3种流动相。结果表明，选择0.01mol/L甲酸(A)-甲醇-乙腈(1∶3，B)作为流动相，20min内6种抗生素基线分离，且无试剂峰的干扰。因为甲酸作为流动相能降低样品的pH值，提高四环素类药物的洗脱效率。

2.3 梯度洗脱程序的选择

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure for tetracyclines separation

图1 6种四环素类抗生素的标准色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 6 TCs standards

2.4 MSPD吸附剂的比较

C18是MSPD萃取中常用的吸附剂[10-11,16]，本实验比较了多壁碳纳米管和C18两种不同吸附的MSPD萃取效果。图2分别为多壁碳纳米管和C18材料的MSPD萃取牛奶加标样品色谱图。结果表明，基于多壁碳纳米管的MSPD对牛奶中6种四环素类抗生素的萃取效率优于C18材料，特别是对土霉素和盐酸四环素萃取效果改善非常明显。

图2 C18材料(A)和多壁碳纳米材料(B)MSPD萃取牛奶加标样品色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of spiked milk with matrix solid-phase dispersion using C18

表2 6种四环素类抗生素的线性回归方程和线性相关系数Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and limit of detections of 6 tetracyclines

2.7 方法的回收率和精密度

在市售牛奶样品中准确加入6种四环素混合标准溶液，制备添加水平为0.2μg/mL和0.4μg/mL的加标样品。按每个添加水平样品重复测定3次，回收率和精密度(RSD)见表3。由表3可知，6种四环素的回收率在78.7%～105.2%之间，精密度均小于12%。

表3 两种加标水平下6种四环素的回收率和精密度(n=3)Table 3 Recoveries and precisions for 6 tetracyclines at two spiked levels (n=3)%

2.5 洗脱液选择及其用量影响

牛奶加标样品经多壁碳纳米材料MSPD处理，分别用甲醇、乙腈及含甲酸的甲醇溶液洗脱，比较发现含甲酸的甲醇溶液洗脱效果最好。优化了洗脱剂的浓度和用量，结果表明：用0.01mol/L甲酸的甲醇溶液5mL进行洗脱，6种四环素的回收率在75%以上。

2.6 线性范围和方法检出限

吸取适量的10.0μg/mL混合标准溶液，以流动相为溶剂，配制6种四环素质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0μg/mL的系列混合标准溶液。在优化条件下，多壁碳纳米管MSPD萃取后HPLC测定。以峰面积为纵坐标，以相对应的标液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。检出限为加标样品RSN=3时相应的质量浓度。线性方程、相关系数(r)及检出限见表2。

3 结 论

研究建立了多壁碳纳米管基质固相分散萃取牛奶中6种四环素类抗生素的高效液相色谱多波长紫外测定方法。方法条件易于控制，结果准确，加标回收率稳定，重现性好。多壁碳纳米管基质固相分散萃取处理牛奶样品中6种四环素类抗生素的回收率明显优于C18。新型吸附材料多壁碳纳米管构建的基质固相分散萃取系统，成本低廉，易于推广到食品等复杂样品中其他农兽药多残留分析。

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Determination of 6 Tetracycline Antibiotics in Milk by Matrix Solid-Phase Dispersion Extraction Using Multiwalled Carbon Nanotubes Coupled with HPLC

WANG Xue-cui，LIU Bing，ZHANG Lu-xin，JI Jing-jing，SHI Jin-qiu，ZHANG Hang，YANG Zong-hui，WU Hong*
(Jiangsu Key Laboratory of Green Synthetic Chemistry for Functional Materials, School of Chemistry and Chemical Engineering, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, China)

A matrix solid-phase dispersion extraction (MSPDE) method was developed to extract 6 tetracycline antibiotics (TCs) from milk samples using multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) as adsorbent prior to high performance liquid chromatography (HPLC) determination. Milk samples, MWCNTs, oxalic acid, and EDTA were evenly ground and then packed into a glass syringe as dispersion column. The analytes were eluted with methanol containing formic acid, and detected by HPLC with variable wavelength detector at 365 nm. The limits of detection (LODs) for 6 TCs ranged from 0.01 to 0.03μg/mL. Their recoveries in spiked milk samples were in the range of 78.7%-105.2% with relative standard deviations of less than 12%. MSPD exhibited higher recovery in extracting 6 TCs as compared to C18column extraction, suggesting that the developed MSPD procedure can be applied for the multiresidues analysis of pesticides and veterinary drugs in foods.

tetracycline antibiotics；matrix solid-phase dispersion extraction；carbon nanotubes；high performance liquid chromatography

O657. 7

A

1002-6630(2011)14-0206-04

2010-10-18

国家质量技术监督检验检疫总局项目(2009IK131)；江苏省自然科学基金项目(BK2008121)；

徐州市科技计划项目(XM08C026)

王学翠(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为分离分析。E-mail：wangxc1978@126.com

*通信作者：吴宏(1968—)，男，教授，博士，研究方向为食品分析样品前处理技术。E-mail：wuhong1968@hotmail.com