黑龙江小麦麦胚多肽的制备及抗氧化功能研究Ⅱ.超滤法精制抗氧化麦胚多肽工艺条件的优化

张洪微，杨铭铎，吴莹莹，张 玲，贾庆胜

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学中式快餐研究发展中心博士后科研基地，黑龙江 哈尔滨 150076；3.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；4.黑龙江生物科技职业学院，黑龙江 哈尔滨 150025；5.黑龙江北大荒丰缘麦业集团有限公司，黑龙江 哈尔滨 150076)

黑龙江小麦麦胚多肽的制备及抗氧化功能研究Ⅱ.超滤法精制抗氧化麦胚多肽工艺条件的优化

张洪微1,2,3，杨铭铎1,2,*，吴莹莹1,2，张 玲4，贾庆胜5

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学中式快餐研究发展中心博士后科研基地，黑龙江 哈尔滨 150076；3.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；4.黑龙江生物科技职业学院，黑龙江 哈尔滨 150025；5.黑龙江北大荒丰缘麦业集团有限公司，黑龙江 哈尔滨 150076)

采用3ku和6ku的超滤膜对麦胚多肽进行分级分离，考察3种分离产物对DPPH·的清除能力，发现分子质量在3ku以下的麦胚多肽对DPPH·的清除率可达75.32%，高于其他分离产物。采用响应面试验方法对麦胚多肽的超滤条件进行优化试验，结果表明，最佳超滤条件为超滤压力0.08MPa、超滤时间23min、超滤pH6.83、溶液质量分数2%，此时膜通量为4.85L/(m2·h)。所得分子质量小于3ku的麦胚多肽在质量分数11%时，其DPPH·清除率为78.93%。超滤法精制的麦胚多肽具有良好的DPPH·的清除能力。

麦胚多肽；DPPH·清除作用；超滤法

小麦胚芽因含有丰富的蛋白质、油脂、碳水化合物、维生素等人体需要的营养素及谷胱甘肽、黄酮类物质和二十八烷醇等生理活性物质而被营养学家誉为“人类天然营养宝库和人类的生命资源”[1-2]。小麦胚芽中的蛋白质含量高达30%，而且氨基酸比例合理，是一种优质的蛋白质资源[3]。麦胚蛋白在酶的作用下多肽链被打断，释放各种肽类化合物，使其功能性质得到改善，并具有一定的生物活性。有研究表明[4]，小麦蛋白经过水解后的多肽具有抗氧化活性，多肽的抗氧化活性还同分子质量有关[5-6]。

超滤技术是在0.05～0.1MPa的静压差推动下，截留蛋白质、酶等相对分子质量大于500u的大分子及胶体，形成浓缩液，达到溶液的净化、分离及浓缩目的[7]。采用超滤技术对酶解后的麦胚多肽进行分级分离，可以得到具有较高抗氧化活性的多肽产品[8]。本实验对麦胚蛋白的酶解产物进行超滤，得到具有较高DPPH·清除能力的麦胚多肽，并采用响应面分析方法对超滤条件进行优化，为麦胚多肽的生产提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦胚芽 黑龙江北大荒丰源麦业；碱性蛋白酶Alcalase F G、木瓜蛋白酶 诺维信酶制剂公司；DPPH· (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 日本Wako公司。

1.2 仪器与设备

3、6ku圆片平板聚醚砜超滤膜、MSC300型杯式超滤器 上海摩速科学器材有限公司；R-205型旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司；ZDO-2型真空冷冻干燥箱 宁夏亚麻技术设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麦胚多肽的制备工艺流程

小麦胚芽→粉碎→过100目筛→脱脂→碱提(pH 10.0)→酸沉(pH4.0) →离心→弃上清液→冷冻干燥→麦胚蛋白粉→酶解→麦胚蛋白酶解物→超滤→冷冻干燥→麦胚多肽

1.3.2 清除DPPH·能力的测定

取一定浓度的样品1mL，加入1×10-4mol/L DPPH·无水乙醇溶液1mL，混均后在室温避光保存30min，在517nm波长条件下测定吸光度，空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH·溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零，所有测定值均为3次结果的平均值，清除率计算[9]公式如下：

式中：A0为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度。

1.3.3 膜通量的确定式中：V为透过液的体积/L；S为膜的有效面积/ m2；t为运转时间/h；L为膜通量/(L/(m2·h))。1.4试验设计

1.4.1 超滤膜的选择

将麦胚蛋白酶解物依次通过6ku和3ku的超滤膜，将麦胚蛋白酶解物分级为＜3、3～6、＞6ku，将分级后的麦胚多肽水溶液进行冷冻干燥，测其对DPPH·清除效果，选择抗氧化效果最好的组分进行超滤条件的确定。

1.4.2 超滤条件的优化

1.4.2.1 单因素试验

超滤时膜通量的大小主要受超滤压力、超滤时间、pH值和溶液质量分数的影响，因此选择以上4个因素进行超滤条件优化的单因素试验，试验水平设计见表1。

1.4.2.2 响应曲面法对超滤条件的优化

根据单因素试验结果，采用Box-behnken试验设计方法对超滤条件进行优化，选取超滤压力、超滤时间、pH值、溶液质量分数4个因素为自变量，以膜通量为响应值，因素水平见表1。

表1 响应曲面分析因素水平设计表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in the response surface analysis

2 结果与分析

2.1 超滤膜的选择结果分析

图1 不同分子质量范围的麦胚多肽对DPPH·清除率的影响Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of wheat germ peptides with different molecular weights

由图1可知，经过分级后的麦胚多肽，其清除DPPH·的能力有所不同。随着麦胚多肽分子质量的降低，其清除DPPH·的能力逐步提高，当分子质量在3ku以下时，其清除能力达到75.32%，比6ku以上的麦胚多肽清除能力提高了17.74%。这是因为经过3ku膜超滤处理的麦胚多肽，除去了大部分的大分子蛋白，使得其疏水性氨基酸含量大大增加，而这些疏水氨基酸对体外抗氧化有着很好的效果。此结论与大豆多肽[10]、鸡胚多肽[11]、鸡骨胶原蛋白肽[12]结论相同。

2.2 超滤条件优化的结果分析

2.2.1 超滤压力对膜通量的影响

图2 超滤压力对膜通量的影响Fig.2 Effect of pressure on membrane flux

由图2可以看出，随着超滤压力的增加，膜通量呈上升趋势，超滤压力由0.05MPa上升到0.07MPa过程中，膜通量上升迅速，而由0.07MPa上升到0.09MPa时，膜通量趋于平稳。这是因为，超滤压力增大的初期，随着超滤压力的增加，膜两侧的压力逐步加大，使得膜通量迅速增加；当超滤压力继续增加时，会很快造成浓差极化现象，而当压力过大时，反而会造成组分中物质的沉积，造成膜通量下降[13]。因此，超滤压力的选择不宜过大，本试验中，选择0.07MPa作为单因素试验中的最佳超滤压力。

2.2.2 超滤时间对膜通量的影响

图3 超滤时间对膜通量的影响Fig.3 Effect of time on membrane flux

由图3可以看出，随着超滤时间的增加，膜通量呈下降趋势，在20～30min内，膜通量下降缓慢，在40～50min时，膜通量下降迅速。这是因为，当超滤时间增加时，造成溶液中组分沉积，浓差极化现象严重，因此，选择适当的工作周期，可以有效地防止膜通量下降，本试验选择30min作为一个工作周期。

2.2.3 超滤pH值对膜通量的影响

麦胚蛋白在pH4时达到等电点，在等电点时，未被酶解的蛋白从溶液中沉淀出来，会造成超滤膜的堵塞，膜通量下降，随着pH值向中性偏移，溶液中的麦胚蛋白不再析出，膜通量上升，而当pH值过高时，碱性环境会造成蛋白的变性[14]，溶液黏度增加，反而不利于超滤的进行。因此，选择pH7作为超滤单因素试验中的最佳pH值。

图4 pH值对膜通量的影响Fig.4 Effect of pH on membrane flux

2.2.4 溶液质量分数对膜通量的影响

图5 溶液质量分数对膜通量的影响Fig.5 Effect of wheat germ hydrolysate concentration on membrane flux

由图5可以看出，随着溶液质量分数的增加，超滤的膜通量逐渐下降，这是因为溶液质量分数越大，超滤时会造成过多的组分沉积在超滤膜上，影响超滤效果。但是，过小的质量分数，会造成超滤过程中的实际膜效能降低[15]，增加后期冷冻干燥的工作量，因此超滤单因素试验中的最佳质量分数为3%。

2.2.5 响应曲面法对超滤条件的优化

2.2.5.1 响应曲面试验设计及结果(见表3)

2.2.5.2 响应曲面试验结果分析

应用Design expert 7.0统计分析软件对表3试验结果进行分析，得到回归方程为：

Y=4.7-0.078A＋0.017B＋0.1C+2.5×10-3D-0.028AB-0.1AC-0.03AD-0.02BC＋0.068BD＋0.06CD＋0.02A2-0.051B2-0.13C2-0.013D2

对所得数据进行方差分析，得到结果见表3。由表3可知，模型项、A、AC影响显著，C、C2影响极显著，失拟项不显著。说明模型的拟合性良好，可以用于模型分析。决定系数和校正决定系数分别为0.7765和0.5531，说明该模型的拟合性良好，可以用于模型分析。本模型的信噪比为7.539，说明该模型可以用于生产应用当中。

表3 麦胚蛋白酶解物超滤条件优化响应曲面试验设计及结果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

由于AC影响显著，作响应面图见图6。由图6可以看出，随着超滤压力的增大，超滤膜通量呈逐渐增加的趋势，在超滤压力达到0.08MPa时，膜通量达到4.72L/(m2·h)；而超滤膜通量随pH值的变化先增大后减小，这是因为麦胚蛋白酶解物在酸性环境中，由于接近其等电点，会造成沉积物析出，而当其处于碱性环境中时，又会造成蛋白的变性。因此，选择中性的pH值超滤效果最好。

通过对回归方程的分析，得到超滤条件的优化结果为超滤压力0.08MPa、超滤时间22.68min、超滤pH6.83、溶液质量分数2.00%。

表4 响应曲面方差分析表Table 4 Variance analysis of the established regression model

图6 超滤压力与超滤pH值交互作用的等高线与响应曲面图Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pressure and pH on membrane flux

2.3 验证实验

根据响应面分析结果进行验证实验，但在超滤时间的选择上考虑实验的可操作性，将最佳的超滤时间修正为23min。在此条件下，膜通量可达到4.85L/(m2·h)，较为理想。同时对超滤精制后的麦胚多肽进行DPPH·清除能力的测定，实验发现，精制后的麦胚多肽其DPPH·清除能力较高，质量分数11%的麦胚多肽溶液对DPPH·清除率达到78.93%，说明麦胚多肽有较强的清除DPPH·的能力。

3 结 论

3.1 分级分离后的麦胚多肽，其抗氧化性能有所不同，其中分子质量在3ku以下的麦胚多肽组分抗氧化活性最高，其DPPH·清除能力可达到75.32%。

3.2 通过单因素及响应曲面法对3ku以下的麦胚多肽超滤条件进行优化，得到最佳超滤条件为超滤压力0.08MPa、超滤时间23min、超滤pH6.83、溶液质量分数2%，此时膜通量为4.85L/(m2·h)。

3.3 精制后的麦胚多肽具有较好的DPPH·清除能力，麦胚多肽质量分数为11%时，其DPPH·清除率达78.93%。

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Preparation and Antioxidant Activity of Germ Peptides from Helongjiang Wheat Ⅱ∶ Optimization of Ultra-filtration Separation of Wheat Germ Peptides

ZHANG Hong-wei1,2,3，YANG Ming-duo1,2,*，WU Ying-ying1,2，ZHANG Ling4，JIA Qing-sheng5
(1. Institute of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Postdoctoral Research Base of the Chinese Fast Food Research and Development Center, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；3. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China；4. Heilongjiang Vocational College of Biology Scienece and Technology, Harbin 150025, China；5. Heilongjiang Beidahuang Fengyuan Wheat Industry Group Co. Ltd., Harbin 150076, China)

Wheat germ protein hydrolysate prepared by enzymatic hydrolysis was separated with ultra-filtration membranes with a molecular weight cutoff (MWCO) of 3 ku and 6 ku, respectively. Four ultra-filtration parameters such as pressure, time, pH and sample concentration were optimized by response surface methodology to be 0.08 MPa, 23 min, 6.83 and 2%, respectively. Under these conditions, the ultra-filtration membrane flux of was 4.85 L/(m2·h). The obtained fraction of less than 3 ku in molecular weight exhibited a DPPH free radical scavenging rate of 78.93% at the concentration of 11%.

wheat germ peptide；DPPH free radical scavenging activity；ultra-filtration

TS210.9

A

1002-6630(2011)14-0171-05

2010-12-17

黑龙江省自然科学基金项目(C201041)

张洪微(1975—)，女，讲师，硕士，研究方向为食品科学。E-mail：fcwei_2004@126.com

*通信作者：杨铭铎(1956—)，男，教授，博士，研究方向为传统食品工业化。E-mail：yangmingduo5663@163.com