超声辅助提取白背三七总黄酮

李 辉，卜晓英，陈功锡，李亚男，梁春凤，谢依蓁

(1.吉首大学生物资源与环境学院，湖南 吉首 416000；2.植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首416000；3.林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000)

超声辅助提取白背三七总黄酮

李 辉1,2，卜晓英3，陈功锡1,2，李亚男1，梁春凤1，谢依蓁1

(1.吉首大学生物资源与环境学院，湖南 吉首 416000；2.植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首416000；3.林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000)

目的：超声辅助提取白背三七干叶、鲜叶、干茎和鲜茎中的总黄酮，探讨超声促进提取的原因。方法：用单因素试验法考察液料比、提取时间和乙醇体积分数对黄酮提取率的影响，并与常规溶剂提取法进行对比。用扫描电镜研究超声处理后白背三七叶片的结构改变。结果：超声提取最优条件为每克植物材料用30mL 70%乙醇溶液提取15min，重复提取2次；对白背三七的相同部位超声提取时，新鲜材料提取率明显高于干的植物材料。结论：超声提取白背三七总黄酮时，提取效率较高、时间短，其高效率可能来源于超声波对材料表明细胞壁的强烈损伤。

超声辅助提取；白背三七；总黄酮

白背三七(Gynura divaricata (L.) DC)为菊科三七草属植物，其根、茎、叶均可入药，具抗肿瘤、抗菌、降血脂、增加机体免疫力等生理活性[1]，可用于治疗支气管炎、肺结核、跌打损伤、风湿痛等疾病。白背三七富含黄酮类化合物，其叶、茎可药食兼用[2]，具有抗病毒、清除人体超氧阴离子自由基、抗衰老之功效[3]，且生长周期短，极易栽培，因而具备较高的开发价值。植物黄酮类化合物的提取，迄今已经发展了多种方法，如常规溶剂提取法[4]、超声辅助提取法[5-6]、超临界流体萃取法[7]、微波辅助提取法[8]等。其中，常规溶剂提取法操作简便，但提取混合物长时间处于高温溶剂中，极不利于热不稳定化合物的提取；超临界流体萃取法，提取环境温和，但提取成本高[9]；微波提取简便快速，但提取化合物也是处于高温溶剂中，且微波作用下的分子偶极改变，可能影响所提化合物的生物活性[10-11]。而超声波辅助提取技术却是在温和条件下，依靠超声空化作用削弱化合物与样品基体的结合力，促进目标物的溶出，特别是对于新鲜植物材料，表现了更加优异的特性，因此是一种高效、低耗的绿色提取技术[12]。本实验探讨超声提取白背三七干、鲜材料中的总黄酮。以期为白背三七总黄酮的提取提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白背三七(自采)：经植物分类学专家陈功锡教授鉴定为白背三七。将采集的白背三七叶、茎洗净，自然风干后，白背三七干叶剪成2mm×2mm小块，白背三七干茎剪成2mm长的小段，置于干燥器中备用。将采集的新鲜白背三七叶、茎洗净，稍干后，叶剪成2mm× 2mm小块，茎剪成2mm的小段，用塑料袋密封置于冰箱中备用。

乙醇(AR)、甲醇(AR) 天津市富宇精细化工有限公司；氢氧化钠(AR) 天津市石英钟厂霸州市化工分厂；硝酸铝(AR) 上海振兴试剂厂；亚硝酸钠(CR) 湘中地质实验研究所；芦丁标准品 中国药品生物制品鉴定所。

1.2 仪器与设备

723A型紫外-可见分光光度计、FA2004型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；电热恒温干燥箱(GZXDH-40×45) 上海跃进医疗器械厂；S-3400N型扫描电子显微镜 日本日立集团；KQ-250E型超声清洗盆(正常功率：250W) 昆州市超声仪器有限公司；回流提取设备 自组装。

1.3 超声辅助提取方法

准确称取待测样品：白背三七干叶、干茎、鲜叶、鲜茎样品3份，每份1g，按设定的液料比(mL/g，20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1)、乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)和提取时间(5、10、15、20、25min)，在超声功率250W条件下提取，过滤，滤渣在相同条件下重复提取2次，合并提取液，定容到200mL。每种样品平行测定3次，取其平均值。采用单因素试验法考察液料比、提取时间和乙醇体积分数对黄酮提取率的影响。

1.4 分光光度法测定总黄酮

1.4.1 标准曲线

以芦丁为参照，精密称取芦丁对照品20mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，摇匀得对照品溶液。分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL对照品溶液置于10mL比色管中，用50%甲醇定容至5mL，加50% NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加0.3mL 10% Al(NO3)3，摇匀，放置6min，加4mL 4% NaOH，摇匀，放置15min后于510nm波长处测定吸光度。参比样品不含芦丁，按同样方法制备。标准方程：y=29.30χ-0.1(y为吸光度，χ为质量浓度/(mg/mL))。

1.4.2 总黄酮提取率测定

吸取各提取液5.0mL于10mL比色管中，按上述标准溶液的制备方法加入试剂，以不含芦丁样品为参比测定各提取液中黄酮质量浓度，按下式计算总黄酮提取率：

1.4.3 白背三七样品中总黄酮含量测定

白背三七样品总黄酮含量用乙醇提取法进行测定[13]。平行称取植物材料5份(每份1.0g)，加70%乙醇10mL，于85℃水浴回流1h，冷却过滤，滤渣再用同样量溶剂重复提取3次，合并提取液，定容，按上述标准溶液制备方法测定提取液中总黄酮质量浓度，用5份样品的平均值作为样品总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 液料比对超声提取率的影响

图1 不同液料比(a)、提取时间(b)及乙醇体积分数(c)条件下白背三七干叶、鲜叶、干茎、鲜茎总黄酮的超声提取率Fig.1 Effects of material-to-liquid ratio, extraction time and ethanol concentration on extraction rates of total flavonoids from fresh and dried samples of different parts of Gynura divaricata L. DC

按液料比(mL/g)分别为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1的溶剂用量超声条件下提取白背三七总黄酮。提取时，干、鲜植物材料均用70%乙醇水溶液为溶剂，提取15min，重复提取2次。总黄酮提取率如图1a所示。结果表明：对于干、鲜白背三七材料，总黄酮提取率随液料比的增加而增大，但当液料比超过30∶1时，提取率趋于稳定。从图1a也可发现，相同条件下对于植物同一部位的超声提取，如叶、茎，新鲜材料的提取率要高于干的植物材料。这可能是由于超声波作用于新鲜植物材料时，对植物细胞壁的破碎作用更为强烈所致。

2.2 提取时间对黄酮超声提取率的影响

超声条件下，每克植物材料用30mL 70%乙醇溶液进行提取，提取时间分别为5、10、15、20、25min，每份材料重复提取2次，黄酮提取率如图1b所示。提取率先随时间增加而增大，但当提取时间超过15min时，提取率反而降低，这表明超声提取植物材料的时间不宜过长。对植物材料的相同部位，提取时间相同时，新鲜材料的提取率明显高于干的材料。特别在提取时间较短时，超声提取新鲜材料的优越性更加明显。

2.3 乙醇体积分数对超声提取率的影响

基于所提取化合物在溶剂中的溶解度差异，分别使用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液为溶剂提取总黄酮。液料比保持30∶1，超声处理时间15min，重复提取2次结果见图1c。由图1c可知，对于所有材料，超声提取率随乙醇体积分数增加而增大，当乙醇体积分数增加到70%以上时，提取率趋于稳定。但在提取新鲜植物材料时，仍可观察到比干的植物材料高的提取率。

通过单因素试验可得，最优的提取条件为液料比30∶1、70%乙醇溶液、超声处理时间15min。且在相同的条件下，植物同一部位新鲜材料的提取率要高于干的植物材料。

2.4 超声辅助提取法与常规方法的比较

称取白背三七新鲜叶片2份，每份3.0g，使用相同的溶剂(70%乙醇溶液)和液料比(30∶1)，分别用超声辅助提取法和回流法进行提取，超声提取15min，回流提取2.5h，结果见表1。由表1可知，两种方法提取相同的植物材料时，超声法可在较短时间得到与常规回流提取较长时间相似的提取率，表明超声辅助提取法的效率更高。

表1 超声辅助提取与回流法提取白背三七总黄酮比较Table 1 Comparison of ultrasonic-assisted extraction and refluxing extraction of total flavonoids from Gynura divaricata L. DC leaves

2.5 超声波对植物叶片表面的作用

提取效率与植物细胞内容物透过细胞壁进入溶剂的溶出过程紧密相关。通常情况下，由于细胞壁内外物质的浓度差，借助于分子运动，胞内物质会通过扩散作用穿过细胞壁而进入溶液。如能借助外力作用破坏植物细胞壁的结构，则会大大加速细胞内物质向溶剂的扩散速度，提高提取效率。为探究超声提取植物材料时的高效率，用扫描电镜观察新鲜白背三七叶片通过超声处理和回流处理后的表面结构变化，如图2所示(放大100倍)。可以发现，超声处理后的植物叶片表面损伤严重，而常规回流处理后的叶片表面仍较完整。这表明超声波与溶剂中的植物材料作用时，对其细胞壁具有较强的破坏作用，从而加速了细胞内容物的溶出过程。

图2 超声提取(a)和回流提取(b)后白背三七叶面扫描电镜图Fig.2 SEM photographs of Gynura divaricata L. DC leaves after ultrasonic-assisted extraction and refluxing extraction

3 结 论

超声提取白背三七总黄酮时，当每克植物材料使用30mL 70%乙醇溶液提取15min，重复提取2次，黄酮提取率最高。对白背三七的相同部位，超声提取新鲜材料时提取率明显高于干的植物材料。超声提取白背三七鲜叶时，处理15min可以得到与常规回流提取2.5h相似的黄酮提取率。超声波辅助提取植物材料的高效率来源于超声波的空化作用对植物细胞壁的损伤，从而促进了细胞内含物质的溶出。

[1]胡勇, 李维林, 林厚文, 等. 白背三七地上部分降血糖作用研究[J].西南林学院学报, 2007, 27(1)∶ 55-58.

[2]陈磊, 宋增艳, 王津江, 等. 白背三七地上部分的化学成分研究[J].中草药, 2010, 33(3)∶ 373-376.

[3]姜曼花, 胡剑卓, 邱文高, 等. 白背三七多糖和黄酮降血糖及耐缺氧作用[J]. 中国医院药学杂志, 2009, 29(13)∶ 1074-1076.

[4]王兰珍, 马希汉, 王妹清, 等. 元宝枫叶总黄酮提取方法研究[J]. 西北林学院学报, 1997, 12(4)∶ 64-66.

[5]ROUHANI S, ALIZADEH N, SALIMI S, et al. Ultrasonic-assisted extraction of natural pigments from rhizomes of Curcuma longa L[J]. Prog Color Colorants Coat, 2009(2)∶ 103-113.

[6]CHEN F, SUN Y, ZHAO G, et al. Optimization of ultrasound assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Ultrason Sonochem, 2007, 14(6)∶ 767-778.

[7]崔旭海. 银杏叶黄酮类化合物提取分离技术的研究进展[J]. 食品工程, 2008(4)∶ 7-11.

[8]范志刚, 麦军利, 杨莉斌. 微波技术对雪莲中黄酮浸出量影响的研究[J]. 中国民族医药杂志, 2000, 6(1)∶ 43-44.

[9]黄盛治, 曹帅, 王丽, 等. 青玉米须总黄酮的提取工艺研究[J]. 吉林化工学院学报, 2009, 26(1)∶ 20-22.

[10]王津江, 陈磊, 宋洪涛, 等. 白背三七总黄酮的提取工艺研究[J]. 中国药师, 2009, 12(2)∶ 146-149.

[11]胡勇, 李维林, 林厚文, 等. 白背三七地上部分的化学成分[J]. 中国天然药物, 2006, 4(2)∶ 156-158.

[12]LI Hui, CHEN Bo, YAO Shouzhuo. Application of ultrasonic technique for extracting chlorogenic acid from Eucommia ulmodies Oliv. (E. ulmodies)[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2005, 12(4)∶ 295-300.

[13]桂劲松, 韦汉燕, 戴平, 等. 白背叶叶中总黄酮含量的测定[J]. 黑龙江医药科学, 2009, 32(3)∶ 24-25.

Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids from Gynura divaricata L. DC

LI Hui1,2，BU Xiao-ying3，CHEN Gong-xi1,2，LI Ya-nan1，LIANG Chun-feng1，XIE Yi-zhen1
(1. College of Biology Resources and Environmental Science, Jishou University, Jishou 416000, China；2. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization of College of Hunan Province, Jishou 416000, China；3. Key Laboratory of Forstry Product and Chemical Engineering of Hunan Province, Zhangjiajie 427000, China)

Objective∶ To optimize the ultrasonic-assisted extraction (UAE) of total flavonoids from dried and fresh leaves and stems of Gynura divaricata L. DC and explore the mechanisms by which ultrasonic can enhance the extraction of total flavonoids. Methods∶ The effects of material-to-liquid ratio, extraction time and ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids were explored by single factor experiments. Scanning electron microscope (SEM) was utilized for examining the structural change of Gynura divaricata L. DC leaves after ultrasonic treatment. Results∶ The optimal UAE conditions were material-to-liquid ratio of 1∶ 30 (g/mL); extraction time of 15 min, ethanol concentration of 70%, and number of repeated extractions of 2. Under these conditions, the extraction rate of total flavonoids from the same parts of fresh Gynura divaricata L. DC was higher than that from dried Gynura divaricata L. DC. Conclusion∶ UAE method has many advantages over conventional solvent extraction such as higher extraction efficiency and shorter extraction time, which is possibly due to severe damage of Gynura divaricata L. DC cell wall by ultrasound.

ultrasonic-assisted extraction (UAE)；Gynura divaricata L. DC；total flavonoids

R284.2；O623.54

A

1002-6630(2011)14-0144-03

2010-09-04

湖南省教育厅优秀青年项目(06B076)

李辉(1968—)，男，副教授，博士，研究方向为生命科学中的分离分析新方法。E-mail：lihuijsdx@163.com