22R序列loop和泡突变对GFP报告基因表达的作用

王红钢，王予东

（1.河南大学医学院 生物化学与分子生物学教研室，河南 开封 475004；2.河南大学医学院 预防医学教研室，河南 开封 475004）

22R序列loop和泡突变对GFP报告基因表达的作用

王红钢1，王予东2

（1.河南大学医学院 生物化学与分子生物学教研室，河南 开封 475004；2.河南大学医学院 预防医学教研室，河南 开封 475004）

目的:我们研究室的前期工作在猴空泡病毒40（SV40）早期mRNA PolyA序列（SV40PolyA）中发现1个活化基因的原件22R（5′－GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT－3′），该片段可以解除 Alu串连序列（或 Line－1重复序列）对GFP报告基因的抑制作用。我们研究22R突变对GFP报告基因表达的作用。方法：将22R及其突变片段插入pEGFP－C1质粒，构建表达载体，瞬时转染HeLa细胞，荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数。结果：AAG、AGA、TGT、TTG和 TGC（22R，野生型）5个质粒促进基因表达作用比较明显。VECT、VEGT、VETA、VETC、VETG和VETT明显促进GFP基因表达。结论：22Rloop和泡的突变对其活化GFP报告基因作用有重要影响。

SV40PolyA；22R；GFP；茎环结构；转染

非编码序列在真核生物基因组中广泛存在，而且在进化上有强制性，所有的真核生物物种及其中的每一个个体都有大量的非编码序列。遗传学有一个著名的命题，即凡是有利的基因被强制保留，凡是有害的基因被强制剔除，凡是无害也无利的基因出现多态性。非编码序列在基因组中强制存在，一定有其重要的生物学功能［1－4］。尽管已经深入研究了非编码序列的功能，但其中大部分序列的功能还不清楚［5］。茎环结构一般都具有保守性，参与多种生物学过程，比如病毒复制、转录终止和 mRNA 成熟［6－10］。

我们课题组以前的研究表明，在pEGFP－C1质粒的GFP基因下游插进含有14个Alu同向重复的片段（Alu14），GFP基因表达明显受到抑制［11］。再将SV40PolyA正反序列插到GFP和Alu14间，结果GFP基因表达明显增强［12］。SV40PolyA序列中哪个片段能够促进GFP基因表达？将SV40PolyA分成4段，经实验证明，第二段2F2R（60bp）有基因活化 作 用，2F2R 中 的 22bp 片 段 （5′－GTG AAAAAAATGCTTTATTTGT）也能活化基因。

1 材料和方法

1.1 材料

pAlu14质粒为本研究室前期工作构建，系将14个Alu元件同向、正向串连插入pEGFP－C1质粒的GFP基因下游。pEGFP－C1质粒为空载体，不含有插入序列。pEGFP－C1质粒、DH5α菌株和HeLa细胞均为我们实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 22R序列茎环结构 用软件分析22R序列，该序列可形成茎环结构，包括1个loop（TGC）、2个茎（AAA／TTT）和1个泡（A／A），见图1。文中将loop碱基突变和泡碱基突变的22R插入pEGFP－C1－Alu14质粒，对GFP报告基因表达的影响。

图1 22R经软件分析的茎环结构

1.2.2 表达载体的构建 合成带有22R突变位点的模板序列，见表1、表2。用带有酶切位点引物PCR扩增合成的模板，引入酶切位点。将突变序列插入pEGFP－C1质粒，利用XbaⅠ和NheⅠ酶切位点可使T4DNA连接酶连接但是连接以后对2种酶均不敏感的特性，制成带有22R突变序列的2串联质粒，将突变的插入序列切下连入C1－Alu14质粒（pEGFP－C1－Alu14）的 GFP基因和 Alu串联序列之间，测序正确后用于实验。

1.2.3 细胞培养 HeLa细胞常规培养于含体积分数为10%的灭活新生小牛血清和抗生素的DMEM培养液中，于37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养，用质量分数为0.25%的胰酶消化，培养瓶温箱培养3d，使细胞处于对数生长期，进行实验。

1.2.4 细胞转染 用质粒（包括重组表达载体和pEGFP－C1）0.4μg和 Lipofectamine TM 2000（Invitrogen Carlsbad，USA）2μL瞬时转染培养于24孔板的HeLa细胞，于37℃、体积分数5%的CO2环境中继续培养36h，用于荧光细胞计数。

1.2.5 荧光细胞计数 细胞转染36h后取出，甩干培养基，每孔加入0.5mL体积分数为4%多聚甲醛PBS固定，固定20min后用PBS洗2遍。在100倍视野白光下计数细胞总数，同样视野紫兰光下计数荧光阳性细胞数，计数细胞总数至少500个，按以下公式计算荧光细胞阳性率。实验数据以均数±标准差（）表示。

2 结果

2.1 22R序列loop突变对GFP报告基因的表达作用

将HeLa细胞用胰酶消化，用DMEM完全培养基配成2×105／mL加入24孔培养板中，每孔0.5mL，于37℃、体积分数5%的CO2条件下培养24h，用构建的插入loop突变序列的质粒转染，每孔转染量均为0.4μg质粒／2μL脂质体。转染后培养36h，固定细胞用荧光显微镜观察荧光阳性细胞的比例，结果见表3。loop的碱基类型显著影响GFP基因表达，AAG、AGA、TGT、TTG和 TGC（22R，野生型）5个质粒促进基因表达作用比较明显（表3中字体斜体加粗标出）。AAA质粒活化基因的作用最弱。

2.2 22R序列泡突变对GFP报告基因的表达作用

HeLa细胞用胰酶消化，用DMEM完全培养基配成2×105／mL加入24孔培养板中，每孔0.5mL，于37℃、体积分数5%的CO2条件下培养24h，用构建的插入泡突变序列的质粒转染，每孔转染量均为0.4μg质粒／2μL脂质体。转染后培养36h，固定细胞用荧光显微镜观察荧光阳性细胞的比例，结果见表4。泡的碱基类型显著影响GFP基因表达，有2个质粒，即VECT、VEGT，促进基因表达与22R（VEAA，野生型）类似，其荧光阳性率分别为2.70%和1.73%，连同22R用空心字体标出（表4）。VETA、VETC、VETG和VETT 4个质粒更加明显地促进GFP基因表达，荧光阳性率分别为5.60%、2.96%、12.76%和20.34%，在表4中，字体斜体加粗标出。这几个插入序列具有高度活化GFP基因作用的质粒，有1个共同的特点，即均含有“AAATAAA”片段，这段序列在活化基因中是否有重要作用，又构建AA、TT、7pieA 和7pieT序列，插入 C1－Alu14质粒的GFP基因和Alu串连序列之间，结果发现，AA序列（GTGAAATAAATGCAAATAAAGT）明显活化基因（表4，序列号17），TT、7pieA和7pieT插入序列活化基因作用较弱或不能活化GFP基因。

表1 构建22R环的突变表达载体的引物或模板

表2 构建22R泡的突变表达载体的引物或模板

表3 22R环的突变对GFP基因表达的影响

表4 22R泡的突变对GFP基因表达的影响

3 讨论

我们查阅到的有关茎环结构对生物学功能影响的文献，其中多数使用病毒作为研究实体。噬菌体N4启动子区含有多个5～7bp长的反向重复序列，反向重复序列间隔3个碱基（形成环），这样的序列可形成茎环结构，是噬菌体生存所必需的［13－14］。

我们观察到22R序列的loop碱基突变中，AAG、AGA、TTG和TGT活化基因作用最强，这4个序列以AG或TG为主，其中AAG与TTG类似，AGA与TGT类似，这样的序列和结构是否有助于活化基因，有待于进一步研究。

我们也查阅到了泡的改变，影响病毒复制工作。有专家［15］报道，病毒的第35个碱基 A（A35）与其他碱基不互补，可形成该区域茎环结构的泡，如果删除A35，它所在区域的序列就完全互补，病毒就无法复制［15］。文中对22R的泡部位全部可能的突变42＝16种排列组合，均作了观察，发现有2个质粒，即VECT、VEGT，促进基因表达与22R（VEAA，野生型）类似，其荧光阳性率分别为2.70%和1.73%（表4），这2个质粒均有 TTTTTTT片段。有TTTTTTT片段的质粒共有4个，即VEAT、VECT、VEGT及VETT，其中除了VEAT（过度互补）以外均可以活化基因。重要的是发现了，VETA、VETC、VETG和VETT插入片段的4个质粒更加明显地促进GFP基因表达，荧光阳性率分别为5.60、2.96、12.76和20.34（表4）。这几个具有高度活化GFP基因作用的质粒有一个共同的特点，即均含有“AAATAAA”序列片段，这段序列在活化基因中是否有重要作用，又构建AA、TT、7pieA及7pieT序列，插入C1－Alu14质粒的GFP基因和Alu串连序列之间，结果发现，AA序列（GTGAAATAAATGCA AATAAAGT）明显地活化基因（表4，序列号17），但是活化基因作用低于VETT序列（GTGAAATAA ATGCTTTTTTTGT，4TMI），看来AAA TAAA 需要和其他序列搭配才可以发挥最好的活化基因作用。我们实验结果初步证明，茎环结构环和泡的突变均影响其生物学功能，只有适当的茎环结构才能活化基因。

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［责任编辑 时 红］

Effect of 22R loop and vesical base mutation on GFP gene expression

WANG Hong－gang1，WANG Yu－dong2（1.Department of Biochemistry and molecular Biology，Medical College，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Department of Preventive Medicine，Medical College，Henan University，Kaifeng Henan 475004，China）

Objective：Our work previously reported one activating gene sequences in early mRNA SV40PolyA，namely 22R（5′－GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT－3′）which can relieve the inhibition of GFP gene induced by Alu tandem sequences.In this study，we mutated 22Rto study the role of DNA structure in its activating GFP gene expression.Methods：The 22Rand its mutated fragments were inserted into downstream of GFP gene in pAlu14to construct expression vector，transfected with HeLa cells and the expression of green fluorescence protein was observed.Results：The changing loop of 22R，AAG、AGA、TGT、TTG and TGC（22R，wild type）had the effects on significantly activating GFP gene expression （marked in black bold）；changing vesical，VECT，VEGT，VETA，VETC，VETG and VETT could obviously activate GFP gene expression.Conclusion：The loop and vesical of 22R are important for 22Ractivating GFP gene.

SV40PolyA；22R；GFP；Stem－loop structure；Transfection

Q786

A

1672－7606（2011）04－0255－05

2011－09－30

王红钢（1975－），男，河南 开封 人，博士，副教授，从事基因表达调节的研究工作。