套式PCR与血清学方法用于检测肺炎支原体感染的对比研究

刘雪梅 唐正宇 谢良依

套式PCR与血清学方法用于检测肺炎支原体感染的对比研究

刘雪梅 唐正宇 谢良依

目的 比较基于16SrRNA的套式PCR与血清学方法对肺炎支原体(Mp)的检出情况。方法 获取医院呼吸内科96例呼吸道标本，设计针16SrRNA特异性引物,用套式PCR法扩增。同时获取双份血清标本检测Mp抗体,比较两种方法的阳性率。结果 套式PCR对Mp的检出率为22.9%,双份血清检出率为18.75%,差异无统计学意义。单份血清检出率为10.4%,套式PCR法对Mp的检出率明显高于单份血清试验。84例发病早期患儿,套式PCR检测出阳性69例,阳性率为82.14%,血清抗体阳性10例,阳性率为12.04%。经统计学分析,P＜0.05。结论 套式PCR和血清学方法均能敏感快速检测Mp感染,但对早期感染而言,套式PCR更有优势。

肺炎支原体;16SrRNA;套式PCR

肺炎支原体(Mp)是引起人类非典型性肺炎的常见病原体，好发于秋冬季，以儿童和青少年多见。本病临床症状呈非特异性，与其他间质性肺炎的病原体引起的肺炎很难区分。支原体细胞膜上与人体某些部位存在共同抗原，感染后可诱导机体产生相应的自身抗体，从而继发地引起全身多脏器损害及各种肺外并发症。诊断支原体肺炎的手段虽然多，但迄今为止尚缺乏特异和敏感的诊断方法[1-2]。本文采用基于16SrRNA的套式PCR技术检测肺炎患儿的Mp感染，同时结合血清抗体的微量板凝集试验为对照，探讨其在Mp分子诊断中的应用价值。

1 研究对象与实验方法

1.1 研究对象 以2010年3月～2010年12月于湖南省人民医院呼吸内科病房住院的肺炎患儿为研究对象。据第7版《实用儿科学》的入选和剔除标准入选患儿共96例：男47例，女48例;年龄4月～14.5岁，平均年龄(6.2±2.5岁)。所有患儿均有不同程度的呼吸道感染临床症状，并排除其他肺外感染性疾病。

1.2 标本采集 所有患儿在入院后24h内完成。患儿漱口后，用无菌咽拭子擦拭患儿咽后壁，随后放置于装有1ml无菌生理盐水的Ep管中，置于-70℃冰箱保供研究使用。同时抽取静脉血lml低温保存供抗体检测用。另外每隔1w用同样方法复查DNA以及血清抗体。

1.3 DNA提取与PCR引物设计 在上述标本于12000rpm下离心10min，去上清。沉淀加入50μlDNA裂解液(按《分子克隆实验指南》第3版配制)，100℃煮沸10min，12000rpm离心10min，取上清备用。引物设计：16SrRNA外套引物：5’-AAG GAC CTG CAA GGG TTGT-3’(上游), 5’-CTC TAG CCATTA CCT GCTAA-3’(下游)。内套引物：5’-CTC TAG CCA TTA CCT GCT AA-3’(上游), 5’-ACT CCT ACGGGAGCK：AGCAGTA-3’(下游)。

1.4 套式PCR反应 第一轮反应：95℃变性5min，随后进入30个以下循环：94℃变性30s，54℃30s，72℃60s。最后一个循环结束后72℃延伸9min。第二轮反应：取第一次反应产物10μl为模版，加入第二套引物，退火温度改为56℃，其余和第一轮反应相同。每次反应设立1个阳性对照、1个阴性对照。

1.5 Mp抗体检测 原理为微量板凝集试验，试剂盒购自日本富士REBIO公司。操作步骤按照试剂盒提供的说明书进行。若单份血清抗体滴度大于1:80或第二份血清与第一份血清相比抗体滴度升高4倍或以上者判为阳性。

1.6 统计学方法 所有资料采用x2检验，P＜0.05判定为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基于16SrRNA的套式PCR与抗体检测阳性率情况 套式PCR对Mp的检出率为22.9%(22/96)，双份血清检出率为18.75%(18/96)，经统计学检验，x2=0.5053，P＞0.05。单份血清检出率为10.4%(10/96)，套式PCR法对Mp的检出率明显高于单份血清微量板凝集试验(x2=5.4，P＜0.05)。以双份血清抗体滴度增高4倍为诊断Mp的“金标准”，套式PCR法的灵敏度为86.4%，特异度为91.3%。

2.2 发病早期两种方法检出率比较 在发病早期就诊的患儿有84例，套式PCR检测出阳性69例，阳性率为82.14%，血清抗体阳性10例，阳性率为12.04%。经统计学分析，x2=83.175，P＜0.05。

3 讨论

鉴于Mp感染有可能引起严重的肺外并发症，且其临床症状与其他病原体引起的非典型性肺炎难以区分，尤其是以肺外症状为首发症状时，临床上极易误诊，因此早期选择快速敏感的诊断方法非常必要[1,3]。目前临床上选用最多的是检测Mp特异性抗体作为确诊指标。对于婴幼儿而言，因免疫系统发育不够完善，因此仅凭抗体检测不可避免存在假阴性。此外，因受时间的限制，从患者体内获取双份血清也存在一定的困难。这些条件不同程度上使抗体检测受到了一定的限制[4]。PCR技术自从开始应用于临床诊断以来，因其灵敏度高、特异性好，且不受集体免疫状态的影响，已经成为早期快速诊断Mp感染的方法。由此衍生的套式PCR敏感性得到了进一步提高[5]。

Mp的分子生物学诊断，靶基因选择很重要。研究发现，以16SrRNA为靶基因比以黏附素P1基因敏感性更高，可在任何感染阶段，尤其是血清学结果为阴性时更有效[6]。本研究发现，在检测Mp抗体的同时，采用套式PCR比较，结果显示，二者检出率无统计学意义。但套式PCR法能更早检测出Mp，与国外报道一致。鉴于支原体内16srRNA含量约为103拷贝，而支原体死亡后，其降解快于DNA，因此标本中16SrRNA阳性时相可能更接近支原体存活的时相[7]。

总之，儿童及婴幼儿Mp的感染率较高，若伴有肺外并发症时，部分患儿可能留有后遗症。应用套式PCR检测Mp16SrRNA能早期快速诊断Mp感染，以便早期给予敏感的抗生素治疗，从而降低各类后遗症的发生。

[1]罗海英.肺炎支原体感染的误诊误治[J].当代医学(学术版), 2007(06):60-60.

[2]Loens K,Goossens H,Ieven M.Acute respiratory infection due to Mycoplasma pneumoniae:current status of diagnostic methods[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(9):1055-1069.

[3]牟红梅,李侠,张燕妮.小儿肺炎支原体感染的肺外表现[J].当代医学,2009,15(09):38-39.

[4]Mulholland S,Gavranich JB,Chang AB.Antibiotics for communityacquired lower respiratory tract infections secondary to Mycoplasma pneumoniae in children[J].Cochrane Database Syst Rev,2010(7):CD004875.

[5]Maheshwari M,Kumar S,Sethi GR,et al.Detection of Mycoplasma pneumoniae in children with lower respiratory tract infections[J].Trop Doct, 2011,41(1):40-42.

[6]Lin C,Li S,Sun H,et al.Nested PCR-linked capillary electrophoresis and single-strand conformation polymorphisms for detection of macrolideresistant Mycoplasma pneumoniae in Beijing,China[J].J Clin Microbiol, 2010,48(12):4567-4572.

[7]Thurman KA,Cowart KC,Winchell JM.Comparison of nucleic acid extraction methods for the detection of Mycoplasma pneumoniae[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2009,65(4):435-438.

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.18.102

410100 长沙市卫生学校医学基础学科部 (刘雪梅 唐正宇) 410100 湖南省人民医院检验科 (谢良依)