CtBP与肿瘤相关的研究

黄承信 曾思恩 肖胜军

肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因相互协同作用的癌变过程。在这个极其复杂的过程中，存在不同肿瘤相关基因的异常激活或失活。羧基末端结合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）在进化上保守，能与多种转录因子相互作用，而主要发挥转录辅抑制因子的功能。它最初是在对腺病毒癌基因E1A的研究中被发现[1]，之后，越来越多的研究表明，CtBP能参与多个肿瘤相关基因的转录调控，而与肿瘤的发生发展密切相关。CtBP已经成为当前肿瘤研究中的热点，可能成为一个新型的抗癌靶点。

1 CtBP的结构和功能

1.1 CtBP的结构

在脊椎动物和非脊椎动物之间，CtBP蛋白家族高度保守。脊椎动物的CtBP由CtBP1基因和CtBP2基因编码，表达产生CtBP1和CtBP2两种蛋白，由于差异性RNA剪接，CtBP1分为CtBP1-L与CtBP1-S两种亚型蛋白，而CtBP2基因编码3种亚型蛋白，其中亚型CtBP2-L和CtBP2-S与CtBP1具有高度同源性[2]。第3种亚型为RIBEYE，主要由1个大的独特的N-末端结构域融合到N-末端缺失20个氨基酸残基的CtBP2所形成的融合蛋白。人类的CtBP基因分别定位在第4号染色体4p16和第10号染色体10q26.13上，CtBP1-L和CtBP2-L是分别由440和445个氨基酸残基构成的高度相似的蛋白质，分子量约48kDa。CtBP在空间上是由它的N-末端区域和C-末端区域，通过2条弹性铰链连接到二骤化作用区域的核心而形成的一个球状结构。CtBP内含有3个不同的结构域：N-末端的底物结合结构域，可特异性识别并结合到含有五肽短保守序列-脯氨酸-X-天冬氨酸-亮氨酸-丝氨酸-（-Pro-X-ASP-Leu-Ser-，PXDLS，X常是Leucine即亮氨酸或是Valine即缬氨酸）的转录抑制因子上，参与转录调控；核苷酸结合结构域或称中心结构域，结合一个NAD（H）分子作为辅抑制活性的调节；C-末端结构域，存在翻译后修饰位点而具有调节功能。在非脊椎动物中只有一种CtBP基因，果蝇dCtBP基因可编码多种蛋白，功能尚未完全明确。脊椎动物与非脊椎动物CtBP均含有与D-2-羟基酸脱氢酶（D-2-hydroxy acid dehydrogenases，D2-HDH）高度同源区域，包括认为存在催化位点保守的NAD（H）结合结构域，因而CtBP具有微弱的脱氢酶活性。但在多个研究中发现这个酶话性的抑制不是必需的。因此，这个脱氢酶活性是否参与CtBP介导的转录抑制目前尚不清楚。

1.2 CtBP的功能

在发育过程中和成熟组织中CtBP1和CtBP2广泛转录表达，在疾病的发生发展过程中发挥重要作用，但在发育过程中的功能尚不甚清楚。由于差异性RNA剪接、翻译后修饰[3]，CtBP存在多个亚型，且各个亚型以时间和空间上的差异化模式进行表达，表现出各亚型存在功能特异性。在脊椎动物，CtBP1-L和CtBP1-S由CtBP1基因通过差异性剪接而编码，而CtBP2-L、CtBP2-S和RIBEYE由CtBP2基因通过选择不同的启动子而产生，CtBP1-L和CtBP2-L、CtBP2-S具有辅抑制因子活性，而CtBP1-S可能参与高尔基体膜分裂，RIBEYE可能具有在中枢神经系统中形成突触的功能。然而，根据CtBP在细胞内的不同定位，其功能也不同。在细胞核，它们发挥转录辅抑制因子作用，而在细胞质，它们参与高尔基体分裂和细胞膜的内吞作用。作为辅抑制因子，在转录调控过程中，CtBP主要是作为募集染色体修饰酶的支架，包括组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs），组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases，HMTs)，募集到结合DNA的转录因子上[4]，进而抑制上皮细胞特异性基因的表达。在非脊椎动物果蝇，由于差异性RNA剪接，单一的dCtBP基因编码两个不同的主要亚型蛋白，称之为CtBPL和CtBPS，这两种亚型蛋白具有相似的抑制功能，但具有不同的发育表达谱。CtBP的作用方式主要是依靠其上的PXDLS结合裂隙与多种含有PXDLS基序的转录因子结合而相互作用，进而调节多种细胞活动过程中有关的靶基因。

2 CtBP与肿瘤的关系

CtBP主要发挥转录辅抑制因子功能，通过参与调控相关基因的转录，促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，抑制多个肿瘤抑制因子，而具有促肿瘤活性；某些肿瘤抑制因子也能靶向降解或下调CtBP而限制它们的促肿瘤活性；在一定条件下，CtBP可以激活基因转录。因此，CtBP与肿瘤的发生、进展关系密切。

2.1 CtBP在EMT中的作用

EMT是正常胚胎发育过程中一种重要的细胞机制，是以上皮细胞极性的丧失及其间质特性的获得为主要特征。研究发现，在肿瘤的原位癌向浸润癌发展以及肿瘤的侵袭转移过程中存在EMT，它是导致肿瘤细胞恶性特征的一个步骤：失去肿瘤中的细胞间粘附分子、获得迁移和侵袭表型以及凋亡抗性。上皮型钙粘蛋白（E-cadherin）普遍存在于各类上皮细胞，介导同型细胞连接，在维持正常上皮细胞形态、极性及组织结构完整性中发挥重要作用，因此，E-cadherin具有拮抗EMT的作用。研究发现E-cadherin具有抑制肿瘤浸润转移的作用[5]，它的表达缺失能增加肿瘤的侵袭能力[6]。在肿瘤的转移过程中，最重要的分子事件就是E-cadherin的表达下调或缺失，在多个上皮性肿瘤中，EMT和E-cadherin表达缺失与肿瘤进展及不良预后相关。已经证实，E-cadherin是CtBP的一个靶基因，CtBP对E-cadherin有抑制作用。有报道多个人类肿瘤中E-cadherin的负调控因子Zeb1过表达和E-cadherin抑制同时存在。在结肠癌中高水平的 Zeb1和CtBP表达与低水平的E-cadherin相关[7]。在多种肿瘤细胞中，转录因子如Twist、Snail、Slug、Zeb2(活性与Zeb1一样)也抑制E-cadherin的表达，而且这些转录因子如Zeb2依赖于CtBP而发挥对E-cadherin的抑制作用[8]。而Snail对E-cadherin的抑制作用可能通过Zeb1间接依赖于CtBP。CtBP介导的E-cadherin转录抑制，在血管生成少、代谢相对活跃的实体瘤中受低氧环境的调节，在缺氧或低氧状态能增加NADH的水平，NADH结合到CtBP能促进CtBP与含有PXDLS基序的转录抑制因子如ZEB的相互作用，增强CtBP对E-cadherin启动子的抑制活性，进而增强肿瘤细胞的迁移能力[9]。

2.2 CtBP与肿瘤抑制因子Ink4家族

Ink4编码区编码3个不同的细胞周期抑制因子：p16Ink4a、p15Ink4b和Ink4a/Arf。p16Ink4a和p15Ink4b在Rb通路中抑制CDK4和CDK6而发挥作用。有相关报道[10]，E1A在人原代纤维母细胞和角化细胞中的表达引起p16Ink4a表达显著增加。在E1A的PLDLS突变的细胞（PLDLS突变的E1A不能与CtBP结合）中却未发现E1A对p16Ink4a 表达的抑制作用，据此推测，E1A是通过与CtBP的结合才发挥了该功能。而CtBP对p15Ink4b的转录抑制作用，则可能通过与其他转录抑制因子相互作用而发挥。ZNF217基因是一个癌基因，它在多种恶性肿瘤中过表达。在基因表达谱分析中发现p15Ink4b 是癌蛋白ZNF217的靶标[11]，癌蛋白ZNF217发挥转录抑制因子的作用，能通过两个基序与CtBP结合，基序PXDLS能与CtBP上的PXDLS裂隙相结合，而基序RRT能与CtBP表面的另一部位结合，在ZNF217与CtBP的相互作用之下，p15Ink4b最终被抑制。CtBP 也可能通过与Zeb1相互作用而在p15Ink4b表达中发挥重要调节作用。有报道，敲除小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts，MEF)中的Zeb1，能引起p15Ink4b表达量的显著增加，由此推测，依赖于CtBP发挥作用的Zeb1对p15Ink4b有抑制作用[12]。而Ink4a/Arf发挥其肿瘤抑制功能的机制之一可能与CtBP有关。有研究表明，CtBP是Ink4a/Arf的直接靶点，在缺乏p53和Arf人结肠癌细胞中导入外源性的Arf，能引起CtBP2下调，而抑制低氧状态下细胞的迁移[13]。

2.3 CtBP与肿瘤抑制因子PTEN

PTEN可以通过抑制PI3K/Akt细胞信号转导途径而抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等促血管新生因子的合成，当肿瘤内VEGF合成减少，肿瘤细胞的浸袭和转移能力将减弱。研究表明，随着肿瘤恶性程度的增加，PTEN的缺失率随之增高[14]，而PTEN的表达缺失或突变可导致多种促血管新生因子的表达增加，促进肿瘤内血管的新生，增强肿瘤细胞的浸袭和转移能力[15-16]。研究表明，CtBP2的瞬时高表达能降低PTEN的表达，同时磷酸化Akt增加[13]，而已知Akt磷酸化时被激活，是个生存信号。也有报道，Snail有抑制PTEN启动子的作用[17]，而哺乳类动物Snail可能通过Zeb1和CtBP发挥作用。因此，CtBP可能通过抑制PTEN而促进肿瘤的发生发展。

2.4 CtBP与肿瘤抑制因子HIPK2

同源结构域相互作用蛋白激酶2（homeodomain interacting protein kinase2，HIPK2)是一个肿瘤抑制因子，它参与诱导细胞凋亡，与肿瘤的发生发展关系密切，主要通过磷酸化作用而发挥功能。HIPK2的作用机制可能包括CtBP磷酸化及蛋白酶体介导的降解。在紫外线（Ultra Violet，UV）暴露的细胞中，CtBP被c-Jun NH2-terminal kinase 1(JNK1)[18]或HIPK2[19]磷酸化，最终导致蛋白酶体介导的CtBP的降解及细胞凋亡。由于在p53阴性的肿瘤细胞中由siRNA介导的CtBP基因沉默可引起细胞凋亡，因此，由HIPK2和JNK1通过降解CtBP而诱导的细胞凋亡似乎不依赖于p53。另外，在缺乏p53表达的H1299肿瘤细胞中，经化疗药物顺铂处理后激活JNK1 而导致CtBP降解和细胞凋亡。由于顺铂处理也同时激活HIPK2[20]，因此HIPK2也有可能以非p53依赖的方式促进顺铂诱导细胞凋亡。根据这些研究结果，我们推测在p53缺乏的人类恶性肿瘤中，CtBP可能成为一个潜在的化疗靶点。

2.5 CtBP与肿瘤抑制因子APC

结肠腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）的编码产物APC，可通过诱导细胞凋亡和调节细胞的粘附功能、细胞周期、细胞迁移而参与肿瘤形成与转移的调节，也是Wnt/β-catenin 细胞信号转导途径中重要的负性调节因子，能结合Wnt 信号途径的多种成分，如Axin、GsK-3β等，正常的APC蛋白与Axin、GsK-3β形成复合物是Wnt 信号途径对细胞增殖、极性等正常调节的保证。研究发现，CtBP和APC具有很强的相互作用，有依据表明APC为蛋白酶体依赖的CtBP1降解提供了一个平台，包括调节β-catenin的稳定性[21]。此外，在结肠癌细胞系中重新导入APC能引起CtBP1下调。而在斑马鱼模型中发现APC突变体与CtBP1高表达相伴存在。另有研究发现，APC可同时靶向β-catenin和CtBP1，而抑制Wnt靶基因的表达和减轻CtBP1靶基因如视黄醇脱氢酶的抑制。因此，除了已知APC在抑制经典Wnt 信号途径中的作用，它还有可能通过与CtBP相互作用而发挥它的肿瘤抑制功能。

2.6 CtBP与多药耐药基因1

CtBP在一定条件下也可以激活基因转录。研究发现，CtBP1能通过直接与多药耐药基因1(multidrug resistant gene 1，MDR1)的启动子相互作用，增强MDR1基因启动子的活性，而激活MDR1基因表达，引起癌细胞内MDR1mRNA及其编码产物P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）过表达，最终导致多药耐药，此外还发现，CtBP1在多药耐药性癌细胞株中过表达，而沉默CtBP1表达能调节多药耐药表型[22]。同时，P-gp在肿瘤细胞膜内含量与多药耐药程度呈正相关性[23]。相似的研究[24]发现特异性短发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）沉默人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR＋/＋)中的CtBP1基因表达后，MDR1基因的转录产物MDR1mRNA随之减少，相应的表达产物P-gp的表达水平显著降低，表现出CtBP1基因表达与MDR1基因及P-gp表达同向性变化，同时MTT法检测细胞增殖发现，shRNA转染细胞对抗肿瘤药多柔比星（adriamycin，ADM）敏感性增加。由上述研究结果我们推测，CtBP1能够激活MDR1基因转录，使P-gp表达量增加，导致肿瘤细胞产生耐药性，CtBP1敲除能增强多药耐药肿瘤细胞株对化疗药的敏感性。因此，CtBP1可能在探索肿瘤多药耐药的调节中提供新的有效手段，可能对于逆转多药耐药有重要的潜在意义。

3 结语

CtBP参与多个基因转录的调控，与肿瘤的发生、发展密切相关，它的发现无疑是为肿瘤的研究提供了新思路。然而，目前对CtBP的具体功能及其发挥抑制肿瘤抑制基因作用的机制、肿瘤抑制基因靶向降解或下调CtBP活性的机制、CtBP的激活基因转录机制等问题还不甚清楚。随着越来越多的涉及CtBP的研究、研究方法的拓宽和研究的不断深入，这些问题会逐步得到阐明。CtBP也可能成为抗癌治疗的一个重要新靶点。

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