女贞子、淫羊藿补肾中药对自发性高血压大鼠主动脉内皮舒缩功能的影响

王雪冰 张 磊 田 允 蔡 晶 (深圳市平乐骨伤科医院，广东 深圳 518010)

补肾中药女贞子为木樨科常绿乔木女贞子(Ligustrum lucidum Ait)干燥成熟果实〔1〕，味甘苦，性凉，归肝肾经，有滋补肝肾、明目乌发的功效，主要用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等症〔2〕。淫羊藿(小檗科箭叶淫羊藿 Epimedium sagittatum，产地四川)的干燥地上部分，为我国传统补益中药，历代本草均有记载。李时珍在《本草纲目》中称其有“辛温，无毒，坚筋骨，益精气，补腰膝，强心力”之功效。目前临床应用远远超过了古人论述的范围，诸多医家经常将其与其他药物配伍，治疗高血压。临床经验及诸多医家报道〔3～5〕，降压西药结合以补肾中药为主药的中药复方治疗原发性高血压，其疗效较单纯应用降压西药为好。我们猜测补肾中药女贞子、淫羊藿减轻高血压患者症状的药理基础可能和心血管的神经内分泌调节有关。本课题利用自发性高血压大鼠(SHR)模型，探讨补肾中药对SHR血管内皮舒张因子NO、收缩因子ET-1及其相应的eNOS、ET-1蛋白和eNOSmRNA、ET-1 mRNA的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12～14周龄自发性高血压大鼠(SHR)40只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔合格证号:NO.SOXK(京)2007-0001〕，雌雄各半，体重(250±10)g;另购同龄同种系京都种大鼠(WKY)10只，雌雄各半，体重(238±10)g，实验前置于福建中医学院动物实验中心清洁级动物室适应性饲养1 w，室温20℃ ～22℃。大鼠全价颗粒饲料由福建中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验药物与试剂 女贞子(木犀科常绿乔木女贞Ligustrum lucidum Ait.的成熟果实，产地福建，由福建医药集团提供)，淫羊藿(小檗科箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum，产地四川，由福建医药集团提供);依那普利(5 mg*16片)为扬子江药业集团产品，批号:国药准字H32026568。NO试剂盒(硝酸还原酶法)由南京建成生物工程研究所提供(批号:20071206)，ET(批号:S10950212)放免试剂盒由北京普尔伟业生物科技有限公司提供。eNOS、ET-1抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。引物由Primer Premier 5.0设计，由Sigma公司合成。引物序列见表1。

表1 各引物序列及PCR产物片段长度

1.3 实验药物制备 女贞子、淫羊藿各38 g，加入500 ml蒸馏水中，浸泡60 min后，煎煮300 ml药液，过滤后装瓶密封消毒，4℃冷藏。依那普利25.2 mg，用双蒸水溶解配成300 ml的水溶液，装瓶密封消毒，4℃冷藏。

1.4 实验动物分组与给药 将40只SHR随机分组为女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组、模型组，每组10只(雌雄各半);另外10只(雌雄各半)京都种大鼠(WKY)作为正常对照组。①女贞子组灌服女贞子水煎液1.58 g·kg-1·d-1，相当于成人常用量。②淫羊藿组灌服淫羊藿水煎液1.58 g·kg-1·d-1，相当于成人常用量。③阳性对照组给予依那普利水溶液1.07 mg·kg-1·d-1，相当于成人常用量。④模型组和正常对照组均灌服同体积的蒸馏水。2次/d灌服，连续灌胃2 w。

1.5 实验仪器 半自动分光光度计BT-224(意大利生物技术公司)，Y放射免疫计数仪 FJ-2008PS(西安核仪器厂);包埋机，病理切片机，倒置光学显微镜数字图像分析系统Ⅰmage Pro Plus 6.0。电泳仪 Biometra公司，型号 High vohag power pack p30;核酸蛋白分析仪Amemham biosciences公司型号Ultrospec 2100pro;台式高速冷冻离心机Hettieh公司，型号Mikro 22R;凝胶成像系统Kodak公司，型号GL200;梯度PCR仪Biometry公司，型号96T;实时荧光定量PCR仪ABⅠ公司，型号7500型。以上仪器均由福建中医药大学中西医结合研究院重点实验室提供。

1.6 血压的测定 给药前SHR大鼠血压由动物单位提供;给药结束后24 h，大鼠麻醉成功，常规消毒，剪去颈部右侧的毛，沿胸锁乳突肌内缘将筋膜分开，即可见右颈总动脉与迷走神经，轻轻分离出右颈总动脉一段(2～3 cm)，穿过两根结扎线，一根扎住远心端，用动脉夹夹住近心端，在靠近近心端结扎线的部位用眼科小剪刀剪一“V”形小口，插入已经注满肝素(40 U/ml)、0.9%生理盐水的PE-50乙烯管(内径0.5 mm，外径1 mm)，用近心端的线固定，打开动脉夹，血流通畅后压力信号经A/D卡输入计算机进行贮存，打印，输出，检测出大鼠血压值(收缩压SBP)。

1.7 血清NO、血浆ET-1的测定

1.7.1 血液标本的采集 给大鼠称重，腹腔注射氯氨酮(0.3 ml/100 g)麻醉，麻醉成功后，常规消毒，腹主动脉采血。其中1 ml注入无抗凝剂的离心管中，低温离心(4℃、3 000 r/min、15 min)，收集上清-20℃保存以备同批测定。取2 ml注入含10%的EDTA二钠30μl和抑肽酶40μl的试管中，混匀，4℃，3 000 r/min离心 10 min，分离血浆，收集血浆-20℃保存以备同批测定。

1.7.2 血清NO与血浆ET的测定 血清NO用半自动分光光度计采用硝酸还原酶法测定，以μmol/L为单位。血浆ET-1采用放射免疫分析法检测，以pg/ml为单位，操作均严格按试剂盒说明书进行。

1.8 主动脉内皮eNOS、ET-1蛋白表达的检测 取2 cm主动脉置于10%甲醛中浸泡固定，包埋，轮转式切片机横断面连续切片，厚度为4μm，烤片60 min，脱蜡，水化，3%H2O2预处理，5%BSA室温封闭20 min，抗eNOS抗体(稀释度1∶50)和抗ET-1抗体(稀释度1∶200)分别加入链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶依次反应和洗涤后，以DAB染色试剂盒显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。以光镜下主动脉内皮细胞胞浆染成浅黄色、棕黄色或棕褐色为阳性着色。按阳性染色细胞所占比例分为3级:阳性染色细胞占15%～35%为弱阳性反应(+);阳性染色细胞占36%～75%为阳性反应(⧺);阳性染色细胞占75%以上为强阳性反应(⧻);利用显微摄像系统在400倍下，每组随机选取10个视野，采用Ⅰmage Pro Plus 6.0图像分析软件半定量分析目的蛋白的表达量，测定主动脉内膜eNOS、ET-1蛋白表达的平均光密度值。

1.9 主动脉内皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的检测 取材后的标本冻存于-80℃冰箱中冻存备用。按照Ⅰnvitrogen公司的TRⅠZOL总RNA提取试剂盒说明书提取组织总的RNA。采用两步RT-PCR法进行测定eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表达。

1.10 统计分析 所有数据应用SPSS15.0统计软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间差异采用方差分析、两两比较的q检验或连续校正t检验。

2 结果

2.1 用药前后各组大鼠血压值(收缩压SBP)的变化 从表2可见:用药前女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组、模型组四组大鼠的血压均高于正常组(P＜0.05);用药后女贞子组、淫羊藿组大鼠的血压较用药前略有下降，但与模型组无差异(P＞0.05)，明显高于正常组(P＜0.05)，用药后阳性对照组大鼠的血压较用药前显著降低(P＜0.05)，与正常组无差异(P＞0.05)。

表2 用药前后各组大鼠血压值的比较(±s，mmHg)

表2 用药前后各组大鼠血压值的比较(±s，mmHg)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05;与用药前比较:3)P＜0.05

组别 n 给药前 给药后女贞子组 10 184.8±15.91) 179.3±10.41)淫羊藿组 10 186.5±17.81) 172.4±9.91)阳性对照组 10 181.2±8.91) 141.8±14.52)3)模型组 10 186.3±14.21) 185.8±7.01)正常组10 136.6±22.6 135.5±16.1

2.2 各组大鼠用药后血清NO、ET比较结果 如表3，与正常组比较，模型组大鼠NO含量明显降低(P＜0.05)，ET-1含量显著升高(P＜0.05);女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组NO含量与模型组比较显著增加(P＜0.05)，与正常组无差异(P＞0.05);女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组ET-1含量显著降低(P＜0.05)，与正常组无差异(P＞0.05)。

表3 给药后SHR血清NO、ET-1含量(±s)

表3 给药后SHR血清NO、ET-1含量(±s)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 n NO(μmol/L) ET-1(pg/ml)女贞子组 10 35.51±6.772) 95.40±8.572)淫羊藿组 10 35.15±7.002) 98.98±10.422)阳性对照组 10 39.00±5.842) 78.06±26.102)模型组 10 16.92±5.841) 136.92±39.381)正常组10 45.10±7.31 76.09±20.30

2.3 各组大鼠主动脉内皮细胞eNOS蛋白、ET-1蛋白的表达

模型组大鼠主动脉内皮细胞eNOS很低表达，ET-1表达呈强阳性，与正常组比较有显著差异(P＜0.05);女贞子组、阳性对照组主动脉内皮细胞eNOS表达呈强阳性表达，淫羊藿组主动脉内皮细胞eNOS表达呈弱阳性表达，三组与模型组比较有差异(P＜0.05);女贞子、淫羊藿组、阳性对照组的ET-1呈阴性表达，与模型组有差异(P＜0.05);正常组大鼠主动脉内皮细胞eNOS表达呈强阳性反应，而ET-1呈阴性表达。见表4。

表4 用药后各组大鼠主动脉内皮eNOS、ET-1表达的比较(±s)

表4 用药后各组大鼠主动脉内皮eNOS、ET-1表达的比较(±s)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 n eNOS ET-1女贞子组 10 0.499±0.0442) 0.323±0.0412)淫羊藿组 10 0.488±0.0692) 0.339±0.0792)阳性对照组 10 0.511±0.0452) 0.316±0.0832)模型组 10 0.394±0.0641) 0.523±0.0751)正常组10 0.553±0.093 0.310±0.089

2.4 各组大鼠主动脉血管内皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表达

2.4.1 eNOS、ET-1和GAPDH基因的定性结果 分别扩增eNOS、ET-1和GAPDH三个基因片段，琼脂糖凝胶电泳分析结果表明PCR产物的大小分别约为418 bp，594 bp，502 bp，与预期设计的扩增产物片段大小基本相符。

2.4.2 主动脉血管内皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表达 如表5所示:模型组大鼠主动脉内皮eNOSmRNA较正常组明显降低，而ET-1 mRNA表达增加(P＜0.05);女贞子、淫羊藿组大鼠主动脉内皮eNOSmRNA表达明显增加，与模型组比较有差异(P＜0.05)，ET-1 mRNA表达明显减少，与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)，与正常组和阳性对照组无显著差异。

表5 给药后各组大鼠主动脉内皮及eNOSmRNA、ET-1 mRNA表达(±s)

表5 给药后各组大鼠主动脉内皮及eNOSmRNA、ET-1 mRNA表达(±s)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 n eNOSmRNA ET-1 mRNA女贞子组 10 0.46±0.0052) 0.43±0.0032)淫羊藿组 10 0.49±0.0022) 0.45±0.0032)阳性对照组 10 0.58±0.0062) 0.24±0.0022)模型组 10 0.28±0.0021) 0.58±0.0051)正常组10 0.49±0.004 0.21±0.004

3 讨论

1993年Ross〔6〕提出内皮功能障碍概念，逐渐深入认识血管内皮细胞(VEC)的功能作用。细胞内NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)催化下合成，有三种一氧化氮合成酶(NOS)，其中eNOS(即NOSⅢ或NOS3)主要存在于血管内皮细胞，参与动静脉血流动力学调节，与心脑血管疾病的关系较为密切NOS是NO合成的关键酶，eNOS介导的内皮细胞释放的基础NO在调节血流和血压方面起到重要作用，可以通过调节eNOS蛋白的表达来调节NO的生成。VEC不仅仅具有屏障作用，还是体内最大的内分泌器官，具有强大的内分泌、自分泌、旁分泌功能，其通过释放血管内皮依赖性舒张因子和收缩因子调节血管平滑肌细胞以维持血管张力，其中NO是血管内皮舒张因子之一;ET是血管内皮收缩因子。ET和NO是一对矛盾统一体二者相互平衡，共同维持血管的张力，维持血管的舒张和收缩功能。血管细胞内分泌功能异常，特别是NO和ET间平衡关系的破坏，必然导致血管舒缩功能紊乱，可表现为血压升高，NO、ET、合成释放失衡是高血压病的重要因素。鉴于原发性高血压的一个重要发病机制就是血管内皮舒缩功能障碍，我们猜测补肾中药为主药的中药复方改善高血压病临床症状的药理基础可能与血管内皮舒缩功能的调节有关，而自发性高血压大鼠是目前公认的最接近人类原发性高血压的动物模型〔6～8〕。

中医认为，高血压的基本病机性质是本虚标实，肝肾阴虚为本，肝阳上亢为标，根据中医治病求本的原则，治以滋补肝肾为主，本研究采用补肾中药女贞子、淫羊藿，探讨补肾中药调节主动脉内皮舒缩因子的分泌，改善主动脉内皮舒缩功能的可能机制。本实验结果显示用药前女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组、模型组四组大鼠的血压均高于正常组;用药后阳性对照组大鼠的血压较用药前显著降低，女贞子组、淫羊藿组大鼠的血压较用药前均略有下降，但与模型组大鼠血压无显著性差异，虽然单味补肾中药女贞子、淫羊藿没有明显降低血压，但略有下降的趋势与中医理论、文献报道以及临床研究所发现的补肾中药为主的复方改善高血压病临床症状这一结论是一致的。

本研究结果提示补肾中药女贞子、淫羊藿能增加主动脉内皮舒张因子NO及其蛋白和基因的表达和降低收缩因子ET及其蛋白和基因的表达，因此单味中药女贞子、淫羊藿没有明显降低血压，但略有下降的趋势，且能调节主动脉血管内皮舒缩因子，我们推测补肾中药为主的中药复方改善高血压患者的临床症状可能与其调节主动脉内皮舒缩因子的分泌，改善主动脉内皮舒缩功能有关。

1 卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部)〔J〕.北京:化学工业出版社，2000:24.

2 张 萍，冯琴琴.女贞子的药理与临床应用研究概况〔J〕.中国药业，2002;11(4):78.

3 万丽艳.补益肝肾配合西药治疗高血压病30例〔J〕.陕西中医，2007;28(2):159-60.

4 姚建宏.降压丸治疗原发性高血压30例临床观察〔J〕.新中医，2001;33(6):37.

5 付立波，夏映红，于 丽.淫羊藿总黄酮对大鼠动脉血压影响及其机制的实验研究〔J〕.中国应用生理学杂志，2007;23(1):115-6.

6 Ross R.The pathogenesis of atheroeclerosis:a perspective for the 1990s〔J〕.Nature，1993;362:801-9.

7 Pravenee M，Zidek V，Landa V，et al.Genetic analysis of cardiovascular risk factor clustering in spontaneous hypertension〔J〕.Folia Biol(Praha)，2000;46(6):233-40.

8 Yagil Y Yagil C.Genetic models of hypertension in experimental animals〔J〕.Exp Nephrol，2001;9(1):1-9.