高压氧预处理对缺血-再灌注诱导的糖尿病大鼠心功能的影响

谷莉娜 郑 杨 谷铁军 王奭骥 (吉林大学第一医院，吉林 长春 3002)

再灌注是目前治疗急性心肌梗死(AMⅠ)最有效的措施，但同时带来的再灌注损伤可加速心肌细胞凋亡坏死，导致心梗面积扩大、心律失常和心功能恶化。减少再灌注损伤可大大改善AMⅠ病人的预后。本研究旨在探讨高压氧预处理对缺血-再灌注诱导的糖尿病大鼠心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 30只健康成年雄性Wistar大鼠，体重250～350 g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

1.2 仪器及试剂 动物实验高压氧舱(烟台冰轮高压氧舱有限公司);BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);电子天平ESJ60-4(沈阳龙腾电子有限公司);电子天平HX5CC1(慈溪市天东衡器厂);灌流液滤过装置(吉林大学基础医学院药理学院);Langerdorff离体灌流装置(沈阳国药集团定制);光学显微镜BX51(日本OLYPUS公司 );石蜡切片机RM 2245(德国 LEⅠCA公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模 30只成年雄性Wistar大鼠，高脂饲料(88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和0.2%胆盐)饲养1个月后给予大鼠2%STZ一次性腹腔注射(40 mg/kg)，1 w后取尾血测血糖，以血糖＞16.7 mmol/L为糖尿病模型成功。大鼠继续常规饲料喂养2个月。

1.3.2 分组及干预 将造模成功的2型糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组(DM-C组，n=10);以K-H液持续灌流120 min;糖尿病缺血-再灌注组(DM-Ⅰ/R组，n=10)，以K-H液稳定灌流20 min后，停止灌流30 min，再灌注120 min;糖尿病高压氧预处理组(DM-P组，n=10):先经过高压氧预处理，其余实验方法同DM-Ⅰ/R组。高压氧预处理方法:先洗舱，以保证舱内处于纯氧状态;然后将大鼠放进动物实验高压氧舱内，以0.2 ATA/min注入纯氧，至压力达到2.0 ATA(标准大气压);当压力稳定后，将大鼠放置60 min;达到规定后时间后，以0.2 ATA/min排放舱内氧气，至舱内压力恢复至正常，1次/d，共7 d。

1.3.3 离体大鼠心脏灌流(Langendorff)模型 Langendorff模型是在恒温恒压条件下，从主动脉根部用氧饱和的K-H灌流液逆向灌流，因逆向灌注关闭了主动脉瓣，类似于在体心脏处于舒张期，停止灌流即模拟全心缺血状态，恢复灌流即全心再灌注开始。具体步骤:取大鼠，秤体重，按5 ml/kg给予20%乌拉坦腹腔注射麻醉后，置于动物台上，固定四肢。迅速开胸取出心脏并立即置于4℃ K-H缓冲液中，轻轻挤压心室，使心腔中残余血排除。开启Langendorff灌流装置，流量约10 ml/min;于液面下在1 min内迅速把主动脉接于灌流的套管上，将大鼠心脏悬挂于Langendorff装置上，并以丝线结扎固定。用95%O2、5%CO2平衡的37℃ K-H液行主动脉逆行恒压灌流，灌流压力为80 cmH2O。剪去左心耳，将带有水囊的压力换能器(事先应排尽空气)通过左心房插入左心室。压力换能器的另一端接于BL-420生物机能实验系统，由其来记录血流动力学变化及室性心律失常发生率。

1.3.4 心肌梗死面积测定 灌流毕，速取心脏，冰冷生理盐水冲洗后剪去心房及右心室，20℃ 10 min。将左心室自心尖向左心底部横切成相等的1～2 mm厚度的数片，放弃心尖和心底部分，以朝向心尖部的切面作为面积分析切面。将心肌切片放入pH7.4，1%TTC磷酸盐缓冲液中，浓度为0.2 mol/L，38℃孵育20 min。冷生理盐水洗去残余染料，非梗死心肌呈红色，梗死心肌不着色，10%甲醛固定24 h。各标本采用固定焦距的数码相机照相。应用德国Ⅰmgage tool图像分析系统计算梗死面积。面积测定方法:以坏死面积之和占总面积的百分比为心肌梗死面积。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，计量资料以±s表示，两组间数据比较用t检验。

2 结果

2.1 血流动力学指标 DM-C组与其他两组离体大鼠心脏平衡期血流动力学指标无明显差异(P＞0.05)。全心灌流120 min内血流动力学无明显变化;DM-Ⅰ/R组缺血30 min，再灌注 10、30、60、120 min 时 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明显降低(P＜0.01);DM-P组在各时间点LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax下降幅度＜DM-Ⅰ/R组(P＜0.05)。见表1。

表1 高压氧预处理对糖尿病大鼠离体心脏LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的影响(±s，n=10)

表1 高压氧预处理对糖尿病大鼠离体心脏LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的影响(±s，n=10)

与DM-C组比较:1)P＜0.01;与DM-Ⅰ/R组比较:2)P＜0.05

组别 缺血即刻 再灌注后10 min 再灌注后30 min 再灌注后60 min 再灌注后120 min DM-C组 LVSP(mmHg) 84±4.43 83±3.69 76±4.94 77.83±4.62 76.67±6.44+dp/dtmax 2 859.33±227.94 2 918.15±401.12 2 985.33±414.78 2 963.17±435.90 2 920.67±553.51-dp/dtmax 2 847.5±302.63 2 874.5±447.03 2 858.33±414.02 2 853.5±428.10 2 729.67±425.15 DM-Ⅰ/R组 LVSP(mmHg) 84.17±5.31 55.83±3.061) 48±6.031) 42.67±3.721) 38.67±3.271)+dp/dtmax 2 913.17±241.55 1 797±303.621) 1 688.17±389.051) 1 465.67±264.051) 1 298.67±156.931)-dp/dtmax 2 861.17±339.43 1 994±265.741) 1 726.17±81.731) 1 619.5±34.061) 1 296.5±13.031)DM-P组 LVSP(mmHg) 82.5±6.06 61.17±4.442) 55±1.792) 49.83±5.192) 42.5±1.762)+dp/dtmax 2 906.33±469.80 2 132±71.272) 2 044±312) 1 769.17±127.352) 1 466.67±35.562)-dp/dtmax 2 899.67±371.15 2 137.83±163.092) 1 975.33±247.262) 1 721.5±87.852) 1 518.5±25.092)

2.2 再灌注后室性心律失常发生情况 DM-Ⅰ/R组发生室性心律失常(多发室性期前收缩、室性期前收缩呈二联律或室性心动过速)5例，DM-P组1例，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 心肌梗死范围 DM-Ⅰ/R组心肌梗死范围为56.05%，DM-P组心肌梗死范围为40.30%，较DM-Ⅰ/R组明显减小(P﹤0.05)。见图1，图2。

图1 糖尿病缺血再灌注组

图2 糖尿病高压氧预处理组

3 讨论

超过1个大气压的压力称高气压。在高气压环境中吸入高浓度氧或纯氧，使氧压或氧分压大于常压纯氧水平的氧，即称为高压氧。高压氧广泛应用于治疗缺血缺氧性疾病。研究表明〔1～4〕，高压氧预处理可减轻大鼠的心肌缺血-再灌注损伤。但高压氧预处理对糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响至今未见报道。本实验通过构建糖尿病大鼠Langendorff离体心脏灌流模型，以探讨高压氧预处理对其离体心脏缺血-再灌注损伤后心功能及心肌梗死面积的影响。

本研究显示，离体糖尿病大鼠给予高压氧预处理后可显著改善再灌注后LVSP以及±dp/dtmax等血流动力学指标及室性心律失常的发生;同时高压氧预处理减少了糖尿病大鼠心肌梗死面积(56.05%vs 40.30%)。考虑到在体实验过程中存在神经调节和机体整体反射活动的参与，本实验采用离体大鼠心脏模型，排除神经因素和机体整体反射活动的影响，观察高压氧预处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保护作用。实验结果证实:高压氧预处理能够减轻糖尿病大鼠心肌再灌注损伤，表现为心肌梗死面积缩小，再灌注后室性心律失常明显减少，血流动力学指标改善。

高压氧可用于防治脏器的缺血再灌注损伤，包括肝脏、心脏、神经系统等，关于高压氧防治缺血再灌注损伤涉及的机制，Chaves等〔5〕研究表明，高压氧通过抑制肝细胞的凋亡保护肝脏的缺血再灌注损伤。Yamashita等〔6〕研究表明，高压氧预处理通过抑制P38蛋白激酶磷酸化发挥神经保护作用，而Li等〔7〕则认为高压氧预处理是通过抑制线粒体凋亡途径治疗大脑的缺血再灌注损伤。关于高压氧预处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保护作用的机制，目前国内外尚无报道。本研究表明，高压氧预处理可抑制糖尿病大鼠心肌细胞的凋亡;但关于高压氧预处理如何实现其抗细胞凋亡，涉及的信号转导通路及行高压氧预处理的最佳疗程尚有待进一步研究。

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3 Aparci M，Kardesoglu E，Suleymanoglu S，et al.Hyperbaric oxygen therapy improves myocardial diastolic function in diabetic patients〔J〕.Tohoku JExp Med，2008;214(3):281-9.

4 Yogaratnam JZ，Laden G，Guvendik L，et al.Pharmacological precondi-tioning with hyperbaric oxygen:can this therapy attenuate myocardial ischemic reperfusion injury and induce myocardial protection via nitric oxide〔J〕?J Surg Res，2008;149(1):155-64.

5 Chaves JC，Fagundes DJ，Simões Mde J，et al.Hyperbaric oxygen therapy protects the liver from apoptosis caused by ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Microsurgery，2009;29(7):578-83.

6 Yamashita S，Hirata T，Mizukami Y，et al.Repeated preconditioning with hyperbaric oxygen induces neuroprotection against forebrain ischemia via suppression of p38 mitogen activated protein kinase〔J〕.Brain Res，2009;1301:171-9.

7 Li JS，Zhang W，Kang ZM，et al.Hyperbaric oxygen preconditioning reduces ischemia-reperfusion injury by inhibition of apoptosis via mitochondrial pathway in rat brain〔J〕.Neuroscience，2009;159(4):1309-15.