茶树无性系后代抗性生理因子的差异研究

王烨军，徐奕鼎，方吴云，夏先江

（安徽省农业科学院茶叶研究所，祁门 245600）

茶树无性系后代抗性生理因子的差异研究

王烨军，徐奕鼎，方吴云，夏先江

（安徽省农业科学院茶叶研究所，祁门 245600）

以自然生长状态下的三年生凫早二号新梢和迎霜、龙井43的留养秋梢茶树叶片为供试材料，通过对茶树无性系后代单株间抗性生理因子的差异分析及其在不同部位的分布规律研究，结果表明：随叶位变化，SOD活性总体呈上升趋势，随着叶龄增加，增长幅度减缓，活性也渐趋于稳定，且茶树无性系后代单株间，SOD、POD、MDA和电导率的差异不显著，个别甚至达到了极不显著水平；对于试验时的取样部位，考虑到修剪、采摘、病虫害、光线、温度等因素影响，建议选用木质化部位的成熟叶叶片，以减少实验误差。

茶树；无性系；抗性；生理因子；酶

叶片的保护性酶活性、组织结构特征、质膜相对透性、可溶性糖含量以及自由水和束缚水含量等各项生理指标，通常作为茶树胁迫抗性的启动因子或表达因子而存在，与茶树胁迫抗性密切相关。近年来，众多科研工作者以盆栽茶苗为试验材料，采用人工调控的方法对茶树抗胁迫能力进行了大量研究，取得了一定进展。然而盆栽茶苗受取样部位及叶片数量的限制，难以满足多项检测内容和持续的实验研究。考虑到茶树无性系后代能保持母本的性状，具有整齐划一的特点，因而以自然生长的茶树为对象，通过对不同叶位及单株间叶片的抗性生理指标的测定，旨在探明茶树无性系后代抗性生理因子的表达差异，探讨茶树抗性研究时以自然生长茶树叶片作为分析材料的可行性及最佳的取样部位。

1 材料与方法

1.1 供试茶园及品种

单株间生理生化指标差异分析：选用安徽省农科院茶叶研究所品种园自然生长状态下的三年生凫早二号；不同叶位生理生化指标差异分析：选用祁门县厉口镇留养秋梢的平地茶园，供试品种为迎霜和龙井43。

1.2 取样时间及方法

2010年5月18日上午8点，随机选取凫早二号茶树5株，每株取芽下第4片叶进行不同单株间生理生化指标差异分析；2010年6月1日上午8点30分，随机选取留养秋梢的3个迎霜枝条和2个龙井43枝条，取成熟叶片第3、第5、第7、第9和第11位叶片进行不同叶位间生理生化指标差异分析。取材时选择无病虫害、生长情况、着生方向基本一致的枝条。取样后，立即装入塑料袋内封口，贮于底部置有冰块的保温箱内，作为供试材料。

1.3 实验样品制备

1.3.1 酶液制备

称取洗净、擦干，去主脉的半边茶树叶片0.5 g（做叶位检测时取0.2 g），剪碎。加入2mL预冷的0.1mol/L的磷酸缓冲液（SOD酶磷缓pH为7.8，POD酶磷缓pH为7.0）和少许石英砂及适量不溶性吡咯烷酮，冰浴中迅速研磨成浆，再加3mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液分次冲洗研钵，洗液转入10mL离心管中，在4℃条件下以4500r/min离心10min，上清液在相同条件下二次离心后用于相关内容检测。

1.3.2 丙二醛的提取

称取洗净、擦干，去主脉的半边茶树叶片0.2 g，剪碎，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加10%三氯乙酸8mL进一步研磨，匀浆在4℃条件下，以4500r/min离心10min，其上清液在相同条件下二次离心后用于检测。

1.4 检测方法

过氧化物酶(POD) 活性测定参考愈创木酚法[1]，略有改动。于试管中加入0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）2.9mL、0.3%愈创木酚1.0mL、0.3%过氧化氢1mL、酶提取液0.1mL，用磷酸缓冲液作空白。在37℃水浴中准确保温15min，立即取出并加入10%三氯乙酸2.0 mL终止反应。然后用1cm比色皿于470nm波长处，测吸光值E470。

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定参考氮蓝四唑（NBT）法[2]；按表1加入各反应液，反应结束后，以不照光的溶液作空白，在560nm波长下测定各管的消光值。

表1 加入反应液用量

细胞质外渗率采用电导率法[3]，略有改动。选取的叶片用蒸馏水冲洗两次，并用洁净滤纸吸干。用直径0.5cm的打孔器避开叶片主脉打取D=0.5cm圆形叶片。称取0.2g样品放入20mL具塞刻度试管中，加入10mL蒸馏水，振荡2h后静置1h，用电导仪测定初电导值(S1)。测毕，将各试管盖塞封口，置沸水浴中10min，杀死组织细胞。取出冷却，在室温下平衡10min，摇匀，测其终电导值(S2)。蒸馏水电导率值（S0）为空白。根据L=S1-S0/S2-S0，计算相对电导度(L)。

茶树叶片丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法[4]，略有改动。于试管中加入提取液2mL，对照管加蒸馏水2mL，然后各管再加入4mL0.6%硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。

气温用温度计测定，叶温利用红外温度测定仪测定。

1.5 数据处理

采用Microsoft Word 和SPSS软件进行处理。

2 结果与分析

迎霜和龙井43茶树叶片中SOD酶活性测定结果见表2。

2.1 不同叶位茶树叶片中SOD酶活性的变化趋势

图1 不同叶位SOD酶活性趋势图

表2 不同枝条不同叶位的迎霜和龙井43茶树叶片中SOD酶活性测定结果（单位：U/g）

在逆境发生时，SOD活性的增加可有效地清除过多的自由基而抑制过氧化作用,从而减轻或避免冻害的发生。低温能增加植物体内活性氧的含量，降低SOD活性，加强膜脂氧化作用。大量的研究认为，SOD活性与植物的抗胁迫能力强弱有很大的关系。本次实验由图1可知：各叶位间活性有一定差异，尤其以第3位叶与其他叶位差异显著，随叶位变化，活性总体呈上升趋势，随着叶龄增加，增长幅度减缓，活性也渐趋于稳定。由图2随机取样检测结果方差分析表明：对于不同枝条而言，各叶位间SOD酶活性非常接近，尤其以第3、第9和第11位叶片活性最为稳定，显著性差异不显著；第5、第7叶位差异稍大。

图2 不同枝条叶位间SOD酶活性差异显著性分析

2.2 不同单株间生理指标差异分析

3年生凫早2号芽下第3位叶生理指标测定结果见表3。

表3 凫早2号不同单株间茶树叶片的生理指标测定结果

由表3知：在同一气温条件下，茶树叶片温度表现不一，但差距不大。各温度下的茶树生理因子并没有呈现出有规律的变化。可见，微弱的温度变化，或者说在某一正常范围内的温度变化，不足以引起茶树生理指标的变化；第4位叶片的SOD酶活性、POD酶活性、电解质外渗率、MDA含量整体表现相对来说还是比较稳定，尤其以两种酶活性稳定性为最，凫早二号无性系后代间的生理指标差异并不显著。

2.3不同品种间生理生化指标差异分析

图3 不同品种间SOD酶活性

对不同品种（迎霜和龙井43）SOD活性的测定结果(图3)表明，迎霜SOD酶活性与龙井43酶活性相比，整体不在一个层次上，处于相同小气候条件，相同管理水平下，相同叶位的迎霜品种的SOD酶活性要比龙井43的SOD酶活性高。经方差分析（图2），迎霜SOD活性与龙井43 SOD活性差异达到极显著水平。这表明SOD酶活性除了受各种环境因子及叶龄的影响外，还与茶树本身的种性有密切关系。在逆境胁迫时SOD活性的高低不但可作为茶树抗性的鉴定指标，还可以作为种性的鉴定指标。

3 讨论

茶树生长发育过程中，各种酶等生理因子的活力与分布是不同的，茶树在代谢过程中，包括了种类繁多的酶或多酶体系的催化过程，它们在茶树体内的形成、激活或阻遏，受到茶树的遗传信息和环境因子等协调作用，这些多酶体系一旦发生折散或逆变，则茶树机体就会失去活性。因而研究茶树的抗性生理对茶树抗性育种、茶树资源抗性鉴定、抗性种质材料的筛选及建立茶树遭受胁迫的预警与调控机制都具有重要作用。近年来，为了提高种质鉴定评价的效果和效率，在鉴定评价方法的标准化、核心种质构建和分子标记技术的应用研究上虽然取得了较大进展，但许多基础理论需要进一步深入研究。

3.1 茶树无性系后代抗性生理因子的差异表达

茶树在进化过程中，形成了一套保护自身免受自由基损伤的系统，其中包括超氧化物歧化酶和过氧化物酶，它们是许多小分子的自由基清除剂，通常被作为植物抗逆性的生理鉴定指标而在逆境生理研究中得到广泛应用。有关抗性生理因子在茶树不同部位中的分布，前人做过大量研究。段亮[5]研究表明：由“幼叶—成叶—老叶”,可溶性蛋白质含量按“中—高—低“的方式变化,MDA含量按“低—中—高”的方式变化,SOD 活性按“低—高—低”的方式变化;叶绿素含量和 CAT 活性在由“成叶—老叶”的变化过程中,按“高—低”的方式变化,而由“幼叶—成叶”的变化不显著或显著性差异程度低。本实验表明：随叶位变化，SOD活性总体呈上升趋势，随着叶龄增加，增长幅度减缓，活性也渐趋于稳定。然而有关茶树无性系后代间抗性生理因子的差异研究却鲜见报道。由图2知：自然生长状态下，茶树无性系后代单株间，相同叶位的抗性生理因子差异并不显著，个别甚至达到了极不显著水平，这表明茶树无性系后代不但能继承母本的形态特征，保持整齐划一的特点，在生理生化特性方面，本质上也具有一致性。若取样方法选择得当，则田间的随机取样，可以代表该茶树的整体性状。

3.2 取样部位的选择

目前，有关茶树生理生化分析还没有统一的取样部位。罗军武，唐和平，黄意欢[6]在研究茶树不同抗寒性品种间保护酶类活性的差异时，选用的是成龄茶树的成熟春叶(自上至下第二叶)；王玉，洪永聪，丁兆堂等[7]在利用茶树叶片解剖结构指数预测茶树种质材料的抗寒性研究中采用的是枝条顶端以下第二张成熟叶片；而魏鹏[8]在研究茶树抗旱性部分生理生化指标时候采用的则是生长高度相近的新梢芽下第2叶和第3叶。本研究表明：茶树抗性生理指标在茶树叶片中的分布以第3、第11位最为稳定，自第7位叶以后酶活性基本维持在一定水平。然而茶树是多年生作物，各种生理指标与外界环境因素及栽培条件和管理水平密切相关。修剪、采摘、病虫害、光线、温度等都会对茶树生理生化因子造成一定的影响。龚志华，黄意欢，罗军武等[9]研究结果表明：重修剪对衰老茶树的保护酶活性影响较大，重修剪后茶树SOD活性提高，CAT活性下降，重修剪处理与对照的酶活性差异达到极显著水平(P0.01)。此外，由于茶树本身具有的品种差异性，因而取样部位是否具有良好的代表性，在很大程度上决定了茶树生理检测的准确性。考虑到外界因子的影响，因而建议取样时尽量选用木质化部位、同一方向、相对完整的成熟叶叶片，以减少实验误差。

[1] 商业部茶叶畜产局,商业部杭州茶叶加工研究所编著.茶叶品质理化分析[M].上海:上海科学技术出版社，1989:476～477.

[2] 王学奎主编.植物生理生化实验原理和技术（第2版）[M].北京:高等教育出版社，2006：172～173.

[3] 邹琦主编.植物生理学实验指导[M].北京:中国农业出版社，2000.

[4] 周祖富,黎兆安主编.植物生理学实验指导[M].北京: 中国农业出版社, 2005.

[5] 段亮.茶树叶片的衰老与保护酶活性及脂质过氧化作用的关系[J].茶叶科学技术，1990, (3)：24～26.

[6] 罗军武,唐和平,黄意欢. 茶树不同抗寒性品种间保护酶类活性的差异[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2001, 27(2):94～96.

[7] 王玉,洪永聪,丁兆堂,等. 利用茶树叶片解剖结构指数预测茶树种质材料的抗寒性[J]. 中国农学通报, 2009, 25(9):126～130.

[8] 魏鹏．茶树抗旱性部分生理生化指标的研究[D]．重庆：西南农业大学，2003．

[9] 龚志华,黄意欢,罗军武,等.重修剪对衰老茶树保护酶影响的研究[J].茶叶科学，2002,(2)：152～155.

S571.1

A

1006-5768(2011)01-0007-05

2010-07-26

王烨军（1976- ），男，安徽石台人，助理研究员，主要从事茶叶生化和育种方面研究。

安徽省农业科学院院长创新基金“温度胁迫下茶树抗性响应机制研究”（10E1301）；现代农业产业技术体系建设专项资金资助。