系统发育标记基因在芽胞杆菌分类鉴定中的应用

田潇娜， 刘国红， 刘 波， 林营志

(1.福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福建 福州 350003； 2.福建农林大学生命科学学院， 福建 福州 350002)

芽胞杆菌(Bacillus)是一种革兰氏阳性菌，能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品具有强抗性的芽胞，能在多种不良环境下存活，分化形成具有特殊功能的菌株。因此，芽胞杆菌在工业、农业、医学、科学领域中被广泛应用，为了更高效地利用芽胞杆菌资源，对芽胞杆菌系统学进行研究，对其分类鉴定方法进行改进就非常必要。

自20世纪90年代以来，分子生物学方法在芽胞杆菌的分类鉴定中得到广泛应用，如DNA-DNA杂交同源性分析、G+C含量分析、16S rRNA序列分析等。16S rRNA因进化速率缓慢，基因产物功能保守，其序列分析是目前细菌的主要系统发育分类方法。但16S rRNA分子较小、包含的信息量也较少，对于亲缘关系较近的细菌一般分辨率较低，存在一定的局限性，只能大概在属的水平上区分细菌，种水平的分类单元一般通过DNA-DNA杂交来鉴定。但DNA-DNA杂交不仅操作复杂，而且操作过程受很多因素影响，因此杂交结果不稳定。随着科学技术的发展，利用系统发育标记基因进行芽胞杆菌的鉴定越来越多，即以进化速率不同的分子为研究对象，进行芽胞杆菌系统发育关系分析。近年来，不断有新的分子标记基因被发现并使用。分子标记基因可以反映生物个体或种群基因组中某种特异性DNA片段的差异，一般所选择的靶基因主要分为2类，即非蛋白编码基因与蛋白编码基因，作为分子标记应具备的条件[1]为：基因普遍存在于各种细菌；对于特殊的生长条件不显示适应性突变；不发生水平转移。目前，使用最广泛的非蛋白编码基因为16S rRNA基因序列分析，一般可以对亲缘关系较远的菌株进行鉴定。蛋白编码基因，可以同时从氨基酸和核酸水平2个信息系统进行分析。如热激蛋白(HSP)相关基因(hsp65、hsp70等)、重组蛋白基因(recA等)、延长因子Tu基因、部分RNA聚合酶基因(rpoB、rpoD等)和DNA拓扑异构酶II的gyrB[2]等，对亲缘关系较近的菌株的鉴定显示了较大的优越性。笔者主要阐述近年来使用较多的分子标记基因gyrB、rpoB、gyrA等基因在芽胞杆菌分类鉴定中的应用。

1 gyrB基因

1.1 gyrB基因的编码蛋白及其功能

gyrB基因即促旋酶(gyrase)B亚单位基因，大小为2 kb的单拷贝持家基因，该基因高度保守，进化较快，平均每5000万年单核苷酸碱基对变化1次。细菌DNA促旋酶由2种亚单位组成[3]，A亚基(gyrA)和B亚基(gyrB)，酶的活性结构是2个A亚基和2个B亚基组成的四聚体，目前还没发现两者之间有连接体。其中B亚基是由gyrB基因编码，分子量约90或70 kDa，具有DNA依赖的ATP酶活性，催化ATP的水解。DNA促旋酶属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的编码蛋白。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组中，编码的是唯一一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶-DNA促旋酶的B亚单位蛋白gyrB。它是一种细菌Ⅱ型拓扑异构酶，在DNA复制及DNA超螺旋结构的维持过程中起着重要的作用。

1.2 gyrB基因在芽胞杆菌系统发育分析中的应用

gyrB基因是目前细菌分类鉴定中系统发育标记的典型代表。自从首次设计出通用引物并从许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中成功扩增出gyrB基因后，由于gyrB基因不显现频繁的基因横行转移，并且基于该基因的序列分析与DNA-DNA杂交的同源性分析有较好的一致性，gyrB基因在芽胞杆菌的系统发育分析及菌株鉴定中被广泛使用，一般研究对该基因进行测序或对其PCR产物进行RFLP分析。gyrB基因的进化和细菌间的分子起源：分子系统研究的模式分子通过构建gyrB和16S rRNA基因的系统进化树展示了细菌间的进化关系，证明了基于gyrB基因的进化树在决定沙雷氏菌之间的系统进化中比16S rRNA更可靠，16S rRNA在描述远源细菌间的关系中比较有用，而gyrB基因在细菌分子间和分子内的系统分析中更具有参考价值。在枯草芽胞杆菌组的鉴定中[4]，通过对同组芽胞杆菌的16S rRNA序列及gyrB基因和DNA-DNA杂交基因的序列相似性进行比较，gyrB基因的相似性与16S rRNA序列相比较低，而和DNA-DNA杂交有较好的一致性，可见gyrB基因可以作为枯草芽胞杆菌的有效地分类鉴定的方法。为了鉴定食物中的菌[5]，利用PCR技术结合限制性内切酶技术，所选芽胞杆菌用Genebank中的引物对gyrB基因进行PCR扩增，用RsaI，Sau3AI和EcoRI等限制性内切酶消化，论证了用gyrB基因特异性序列鉴别食物中蜡状芽胞杆菌组的可能性。gyrB基因的PCR-Sau3AI指纹图谱[6]也可以鉴定苏云金芽胞杆菌，正如Yamada et al[7]报道的它避免了使用3种特殊的引物进行菌株的鉴定。

基于gyrB基因的数据库ICB[8]，为gyrB基因作为进化和分类标记提供了参考点和研究平台。不仅包括菌株的核苷酸和氨基酸信息，可以进行不同分类水平的序列比对，还提供菌株鉴定的引物选择和背景信息。Bavykin et al[9]利用16S rRNA、23S rRNA和gyrB基因序列研究了蜡状芽胞杆菌组的进化关系，对蜡状芽胞杆菌组183株和74株菌分别进行了16S rRNA和23S rRNA序列分析，并对30株经过16S rRNA鉴定的该组菌进行gyrB序列分析，结果蜡状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌3种基因序列分析都表现出异质性，而炭疽芽胞杆菌表现出同源性，证明了gyrB基因序列分析可以把炭疽芽胞杆菌从蜡状芽胞杆菌组中分离出来。Soufiane et al[11]在鉴定H血清型苏云金芽胞杆菌时对16S rRNA，gyrB和aroE基因序列分析，3种基因都可以鉴定H血清型苏云金芽胞杆菌，而gyrB和aroE基因显示了极大的优势，但gyrB基因可以作为从H血清型苏云金芽胞杆菌和同一血清型苏云金芽胞杆菌中鉴定菌株的最佳标记基因。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱[11]作为一种蛋白分析鉴定细菌的工具，在短小芽胞杆菌的鉴定中对其功能的验证不仅利用16S rRNA基因进行鉴定，更进一步用gyrB基因进行了鉴定。在鉴定新月红色进口火蚁中的芽胞杆菌时[12]gyrB基因与GenBank基因序列相比达到了95.48%到100%的匹配值，由此可见在芽胞杆菌鉴定中gyrB基因的使用是很广泛的。

1.3 gyrA基因在芽胞杆菌系统发育分析中的应用

gyrA即促旋酶(gyrase)的A亚单位基因，它和DNA促旋酶gyrB基因相连。A亚基由gyrA编码，分子量约100 kDa，具有磷酸二酯酶活性，负责DNA断裂和重接。由于其具有与gyrB基因类似的结构和功能，因此可以作为菌株系统发育标记。中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection， CICC)采用gyrA基因序列分析技术，对其保存的36株枯草芽胞杆菌菌群进行系统发育分析，得到与16S rRNA基因序列分析一致的拓扑结构系统发育树，位于3个不同的系统发育分支间菌株的gyrA基因序列相似度在75.3%-95.3%之间，远低于16S rRNA基因序列相似度。gyrA基因序列分析对枯草芽胞杆菌群菌种的分辨率高于16S rRNA基因充分显示了该基因用来鉴定芽胞杆菌的优势，因此有望成为工业用枯草芽胞杆菌菌种鉴定的一个有力工具。gyrA基因在其他相关芽胞杆菌的鉴定中也显示了相对16S rRNA序列分析的优势及DNA-DNA杂交的一致性。

2 rpoB基因

2.1 rpoB基因的编码蛋白及其功能

rpoB基因，编码RNA聚合酶的β亚单位，被作为菌株鉴定和系统进化的标记。基于rpoB基因的RT-PCR[13-14]已被用作鉴定蜡状芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌，尤其在鉴别蜡状芽胞杆菌组的炭疽芽胞杆菌中使用较多。部分rpoB基因序列，位于进行RT-PCR的下游区域，它包括一段利福平耐药性区段[15-16]，可以进行炭疽、蜡状、苏云金、蕈状和巨大芽胞杆菌等的基因型比较分析。韩国学者Ko et al[17]对炭疽芽胞杆菌及其近缘种蜡状芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的rpoB基因进行了序列比较分析，系统进化分析表明炭疽芽胞杆菌分为单独的一支，因此认为rpoB基因可作为毒性炭疽芽胞杆菌的有效快速的鉴定方法。明胶产品的污染是目前备受人们关注的问题，产品经过高温处理后仍存在细菌污染，Clerck et al[18]从明胶半成品提取物中分离到1129株菌，通过16S rDNA进行初步筛选，再通过gyrA和rpoB序列的rep-PCR技术进行鉴定，大多数菌株被鉴定为芽胞杆菌菌株。多项研究[19-20]均充分验证了rpoB基因在枯草芽胞杆菌组及其相关菌株的鉴定中是非常有效的。

2.2 rpoB基因在芽胞杆菌系统发育分析中的应用

2000年[21]基于rpoB基因的微生物群落分析就表明16S rDNA在种内鉴定存在局限性。如今rpoB基因在医学、临床诊断和生态研究、环境监测等方面已被广泛使用，一般结合限制性片段长度多态性和多项分析进行研究。临床上[22]使用rpoB基因检测炭疽芽胞杆菌，根据复合探针荧光定量分析原理，以炭疽芽胞杆菌染色体上的rpoB基因为靶序列，设计合成引物和探针，进行实时定量聚合酶链反应(PCR)检测，该法检测炭疽芽胞杆菌的灵敏度很高，能特异区分炭疽芽胞杆菌与其他蜡样芽胞杆菌。rpoB基因[23]代替16S rDNA用来鉴定固氮类芽胞杆菌，可以结合多重PCR等技术把炭疽芽胞杆菌从蜡状芽胞杆菌中分离出来。Meintanis et al[24]运用REP-PCR和BOX-PCR技术对Geobacillus属菌株及芽胞杆菌模式菌株的rpoB基因序列进行了相似性分析，进化树分析表明rpoB基因序列相似性远低于16S rDNA序列相似性，因此，基于rpoB基因的REP-PCR和BOX-PCR技术可以进行Geobacillus属的分子分型，rpoB基因是Geobacillus属优于16S rDNA的准确有效的鉴定方法。Ki et al[25]则将20株分离自海洋环境的芽胞杆菌通过16S rDNA序列比较,分为13个基因型和9个种，而基于rpoB基因的进化树是16S rDNA的4.5倍，说明rpoB的基因多态性可以作为芽胞杆菌鉴定的标记。为了克服16S rDNA 鉴定Geobacillus属菌株的局限性，Weng et al[26]也通过recA和rpoB基因序列比较对Geobacillus属菌株进行了进化分析和分子鉴定，rpoB基因序列分型显示了更高的一致性，以此可以作为Geobacillus属高效便捷的鉴定方法。

3 rpoD基因

枯草芽胞杆菌RNA聚合酶至少以5种聚合酶的形式存在[27]，尤其是在细胞内每种酶对应1种σ因子作为特异性启动子。RNA聚合酶的主要形式为43 000 Da的σ因子，是由rpoD基因编码的，与大肠杆菌RNA聚合酶的主要σ因子同源。枯草芽胞杆菌聚合酶σ43包括3个基因：P23，dnaE和rpoD(σ43)，3个基因紧密的连在一起。在细菌生长的不同时期，2个重叠σ43启动子控制操纵子的表达，而σ37启动子在孢子形成时期调节操纵子的表达。rpoD基因处于aroD和lys基因之间，与dnaE基因相连，属于crsA基因的一部分，其基因序列为acf-aroD-dnaE-rpoD(crsA)-spoOG-lys。rpoD基因的上游编码区为dnaE基因，它编码62 000 Da的蛋白，该蛋白对DNA复制是非常重要的，并且2个基因在染色体上为同方向逆时针转录，因此，rpoD基因的功能和结构与大肠杆菌的操纵子相似[28]。研究表明基于氨基酸序列合成的核酸探针在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中主要σ因子的合成中是非常保守的，可以用来鉴定不同真细菌的rpoD同源基因。在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的假定编码区和主要的σ因子区有13个氨基酸序列是非常普遍的，可以作为σ因子和主要σ因子的特征。这些基因被命名为hrdA，hrdB，hrdC和hrdD。据此设计的探针在检测各种真细菌rpoD基因的同源性时显示了很好的杂交信号。可见rpoD基因也是比较保守的，它特殊的结构和功能决定了rpoD基因可以作为系统发育标记。rpoD基因在芽胞杆菌鉴定中应用较少，Matsuura et al[29]在鉴定Erwiniaamylovora时对16S rRNA，gyrB和rpoD基因等分子标记进行了分析，证明了rpoD基因在细菌鉴定中的优势。

4 cry基因

苏云金芽胞杆菌(Bt)制剂是目前国内外应用最广泛的微生物杀虫剂，其杀虫的主要活性成分是由杀虫蛋白基因(cry基因)编码，并于营养期或芽胞形成期产生的杀虫晶体蛋白(ICPs)。根据Crickmore et al[30]确立的新的分类规则，它们分别被确立为53个群、169类、386个亚类杀虫蛋白基因，因此cry基因家族成为苏云金芽胞杆菌鉴定的金标准。赵银娟等[31]从连云港海域中筛选出1株较有潜力的高活性Bt菌株，对其生物学特性进行了研究，同时也用cry基因证实了该菌的特殊性。枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、短小芽胞杆菌和环状芽胞杆菌是5种环保微生物制剂中常用的芽胞杆菌，针对这些菌的传统理化检测方法费时费力，程琳琳等[32]建立了一种快速、准确的检测方法，不仅使用GenBank上已有gyrB基因序列分别设计和筛选上述菌种的特异性引物，还利用rpoB、gdh系统发育标记经优化建立了PCR快速有效检测方法。炭疽芽胞杆菌含有毒性质粒基因pXO2，可以使细菌产生荚膜，pXO2上的cap基因在鉴定炭疽芽胞杆菌中已被使用，陈苏红等[33]为建立一种简便的炭疽芽胞杆菌检测方法作临床诊断工具，以pXO1质粒上的pag基因及pXO2上的cap基因为靶标合成特异引物，进行定量PCR扩增来检测目的产物，该法检测炭疽的灵敏度很高，并且能区分炭疽芽胞杆菌与其它蜡样芽胞杆菌。parE基因[34]为拓扑异构酶IV的编码基因，可以对嗜热菌Geobacillus属的菌株进行鉴定，作为管家基因在地衣芽胞杆菌组的鉴定中也被用作标记基因。Hua et al[35]在16S rRNA鉴定的基础上通过管家基因gyrB和parE分别验证了日本和敦煌2个地区枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌的同源性，证明了东亚北部黄土转运微生物事件。

5 讨论

基因的系统发育分析在细菌分类鉴定中占有重要地位。随着分子生物学和测序技术的发展，DNA大规模测序得以进行，传统鉴定细菌的方法，在某些方面被一种可定量、较精确的以可翻译核苷酸序列为基础的分析方法所取代。因此，以核苷酸序列为基础的分析，要求选择合适的靶基因进行比较分析。适合于系统发育研究的保守基因在其进化过程中都面临着巨大的选择压力，非编码蛋白基因如16S rRNA基因与蛋白编码基因相比，不同之处是在进化过程中受到不同的约束条件，蛋白编码基因由于密码子的简并性，具有更大的变化，在细菌的鉴定中提供了更精确的信息，因此，在菌株分类鉴定中已被频繁利用，gyrB、rpoB、gyrA和parE等基因在不同种芽胞杆菌的鉴定中各有优势。基于基因序列标记的芽胞杆菌系统发育分析等研究目前已广泛展开，但是，要想获得更精确的分子标记仍然需要不断的研究和探索。随着测序技术的发展，细菌基因序列的分析和比对逐渐变得较为容易，因此应用分子标记基因进行系统发育分类将不断深入研究。

[1] 侯晓丽,陈智.分类及鉴别细菌的新靶标-gyrB基因[J].国外医学·流行病学传染病学分册,2005,32(1): 38-41.

[2] 郝云婕,韩素贞.gyrB基因在细菌系统发育分析中的应用[J].生物技术通报,2008,2: 39-41.

[3] 安然,易图永.gyrB基因在细菌分类和检测中的应用[J].江西农业学报,2010,22(4): 18-20.

[4] Wang L T, Lee F L, Tail C J, et al. Comparison ofgyrBgene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in theBacillussubtilisgroup[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007,57(8):1846-1850.

[5] Manzano M, Cocolin L, Cantoin C, et al.Bacilluscereus,BacillusthuringiensisandBacillusmycoidesdifferentiation using a PCR-RE technique[J]. Internationnal Journal of Food Microbiology, 2003,81(3):249-254.

[6] Awad M K, Saadaoui L, Rouis S, et al. Differentiation betweenBacillusthuringiensisstrains bygyrBPCR-Sau3AI fingerprinting[J]. Molecular Biotechnology, 2007,35(2):171-177.

[7] Yamada S, Ohashi E, Agata N, et al. Cloning and nucleotide sequence analysis ofgyrBofBacilluscereus,B.thuringiensis,B.mycoides, andB.anthracisand their application to the detection ofB.cereusin rice[J].Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(4):1483-1490.

[8] Watanabe K, Nelson J, Harayama S, et al. ICB datebase: thegyrBdatebase for identification and classification of bacteria[J]. Nucleic Acids Research, 2001,29(1):344-345.

[9] Bavykin S G, Lysov Y P, Zakhariev V, et al. Use of 16S rRNA, 23S rRNA, andgyrBgene sequence analysis to determine phylogenetic relationships ofBacilluscereusgroup microorganisms[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004,42(8):3711-3730.

[10] Soufiane B, Cté J C. Discrimination amongBacillusthuringiensisH serotypes, serovars and strains based on 16S rRNA,gyrBandaroEgene sequence analyses[J]. Antonievan Leeuwenhoek, 2009,95(1):33-45.

[11] Dickinsan D N, La Duc M T, Satomi M, et al. MALDI-TOFMS compared with other polyphasic taxonomy approaches for the identification and classification ofBacilluspumilusspores[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004,58(1):1-12.

[12] Gunawan S, Tufts D M, Bextine B R. Molecular identification of hemolymph-associated symbiotic bacteria in red imported fire ant larvae[J]. Current Microbiology, 2008,57(6):575-579.

[13] Ellerbrok H, Nattermann H, Özel M, et al. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenicBacillusanthracisby real-time PCR[J]. Federations of European Microbiology Societies, 2002,214(1):51-59.

[14] Qi Y, Patra G, Liang X, et al. Utilization of therpoBgene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection ofBacillusanthracis[J]. Applied Environmental Microbiology, 2001,67(8):3720-3727.

[15] Nicholson W I, Maughan H. The spectrum of spontaneous rifampin resistance mutations in therpoBgene ofBacillussubtilis168 spores differs from that of vegetative cells and resembles that ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Journal of Bacteriology, 2002,184(17):4936-4940.

[16] Thwaite J E, Baillie L W J, Carter N M, et al. Optimization of the cell wall microenvironment allows increased production of recombinantBacillusanthracisprotective antigen fromB.subtilis[J].Applied Environmental Microbiology, 2002,68(1):227-234.

[17] Ko K S, Kim J M, Kim J W, et al. Identification ofBacillusanthracisbyrpoBsequence analysis and multiplex PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003,41(7):2908-2914.

[18] De Clerck E D, Vanhoutte T, Hebb T, et al. Isolation, characterization, and identification of bacterial contaminants in semifinal gelatin extracts[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004,70(6):3664-3672.

[19] Chun J, Bae K S. Phylogenetic analysis ofBacillussubtilisand related taxa based on partialgyrAgene sequences[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2000,78(2):123-127.

[20] Fox G E, Wisotzkey J D, Jurtshuk P. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1992,42:166-170.

[21] Dahllof I, Baillie H, Kjelleberg S. RpoB-based microbial community analysis avoids limitations inherent in 16S rRNA gene intraspecies heterogeneity[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(8):3376-3380.

[22] 陈苏红,张敏丽,牟航,等.一种快速定量检测炭疽杆菌方法的建立[J].中华检验医学杂志,2003,26(3): 98-100.

[23] da Mota F F D, Gomes E A, Paiva E, et al. Use ofrpoBgene analysis for identification of nitrogen-fixingPaenibacillusspecies as an alternative to the 16S rRNA gene[J]. Letters in Applied Microbiology, 2004,39(1):34-40.

[24] Meintanis C, Chalkou K I, Kormas K A, et al. Application ofrpoBsequence similarity analysis, REP-PCR and BOX-PCR for the differentiation of species within the genusGeobacillus[J]. Letters in Applied Microbiology, 2008,46(3):395-401.

[25] Ki J S, Zhang W, Qian P Y. Discovery of marineBacillusspecies by 16S rRNA andrpoBcomparisons and their usefulness for species identification[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009,77(1):48-57.

[26] Weng F Y, Chiou C S, Lin P H P, et al. Application ofrecAandrpoBsequence analysis on phylogeny and molecular identification ofGeobacillusspecies[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009,107(2):452-464.

[27] Johnson W C, Moran C P, Losick R. Two RNA polymerase sigma factors fromBacillussubtilisdiscriminate between over-lapping promoters for a developmentally regulated gene[J]. Nature, 1983,302:800-804.

[28] Tanaka K, Shiina T, Takahashi H. Multiple principal sigma factor homologs in eubacteria: Identification of the‘rpoDbox’ [J]. Science, 1988,242(4881):1040-1042.

[29] Matsuura T, Shinohara H, Inoue Y, et al.Erwiniaisolates from the bacterial shoot blight of pear in Japan are closely related toErwiniapyrifoliaebased on phylogenetic analyses ofgyrBandrpoDgenes[J]. Journal of General Plant Pathology, 2007,73(1):53-58.

[30] Crickmore N, Zeigler D R, Feitelson J, et al. Revision of the nomenclature for theBacillusthuringiensispesticidal crystal proteins[J]. Microbiology and Moleculer Biology Reviews, 1998,62(3):807-813.

[31] 赵银娟,魏炜.一株海洋来源的的高活性Bt菌的生物学特性研究[J].微生物学杂志,2008,28(4): 43-46.

[32] 程琳琳,王芳,金莉莉,等.环保微生物菌剂常用5种芽胞杆菌的PCR鉴定[J].微生物学杂志,2009,29(4): 36-40.

[33] 陈苏红,张敏丽,牟航,等.实时荧光定量PCR法检测炭疽杆菌[J].解放军医学杂志,2003,28(3):268-270.

[34] Tourova T P, Korshunova A V, Mikhailova E M, et al. Application ofgyrBandparEsequence similarity analyses for differentiation of species within the genusGeobacillus[J]. Microbiology, 2010,79(3):356-369.

[35] Hua N P, Kobayashi F, Iwasaka Y, et al. Detailed identification of desert-originated bacteria carried by Asian dust storms to Japan[J]. Aerobiologia, 2007,23(4):291-298.