噬菌体治疗耐药性幽门螺杆菌的研究进展

熊 婧，白 杨

南方医科大学南方医院消化内科，广东广州510515

噬菌体是特异性感染细菌的一类原核生物病毒，分别由Towort和Herelle在20世纪初从葡萄球菌和志贺菌中首先发现。噬菌体可分为毒性噬菌体和温和噬菌体两大类。毒性噬菌体感染宿主菌后，能在宿主菌细胞内独立复制增殖，产生多个子代噬菌体，并最终裂解细菌。温和噬菌体则将其基因组整合至宿主菌染色体中，不独立复制，随细菌的分裂而传代，不裂解细菌。因此可利用毒性噬菌体治疗细菌感染。早在1919年噬菌体刚发现不久，东欧和前苏联便开始运用噬菌体来治疗细菌感染，但二战后抗生素的广泛使用及不纯的噬菌体制剂细菌抗原的存在会引起免疫反应等因素阻碍了西方国家对噬菌体治疗疾病的研究。

幽门螺杆菌(H．pylori)是临床重要致病因子，已经确认H．pylori与胃肠道疾病中的慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤4种疾病关系密切［1］。H．pylori呈世界范围分布，约有50%的人感染。根治H．pylori能有效治愈溃疡、预防胃癌等。目前尚无单一药物可根治H．pylori感染，临床上主要以质子泵抑制剂(PPI)加克拉霉素再加阿莫西林或甲硝唑的三联治疗方案根除率最高，可达80%～90%;但近些年，由于H．pylori对抗生素耐药性的产生，主要是对甲硝唑和克拉霉素的耐药，导致根除率下降至70% ～80%［2-9］。因此，寻找新的方法替代抗生素治疗H．pylori感染是非常必要的，而噬菌体在这方面有着极大的潜力。

1 幽门螺杆菌耐药的一般情况

1．1 随地区分布而不同 不同国家甚至同一国家不同地区由于当地习惯使用的抗生素不同导致H．pylori对各种抗生素耐药率不同。一般来说，发展中国家耐药情况比发达国家严重。继发耐药也比原发耐药严重。抗H．pylori的抗生素常用于其他系统疾病而导致普遍耐药。如甲硝唑常用于寄生虫疾病、妇科和牙科感染;克拉霉素常用于呼吸系统感染;阿莫西林常用于链球菌咽炎和泌尿系统感染;四环素常用于呼吸系统、肠道疾病及预防旅行者腹泻和霍乱;呋喃唑酮用于治疗贾第鞭毛虫病。我国于2005年对19个省市H．pylori耐药流行病学调查［10］表明不同地区甲硝唑耐药率存在较大差异，其耐药率为 50% ～100%(平均73.3%)、克拉霉素0～40%(平均23.9%)、阿莫西林0～2.7%。2007年张虹雨等［11］对昆明地区70例H．pylori阳性胃黏膜标本研究发现H．pylori对克拉霉素耐药率11.4%(8/70)，甲硝唑耐药率为77.1%(54/ 70)，阿莫西耐药率为0。2009年宋红蕾等［12］从苏州地区141例消化性溃疡患者中分离出并成功传代56株H．pylori，发现甲硝唑的耐药率为42.9%，克拉霉素耐药率为16.1%。2010年蔡跃芳等［13］发现东莞市H．pylori甲硝唑耐药率高达89.5%(68/76)，克拉霉素为27.6%(21/76)，阿莫西林为6.6%(5/76)，呋喃唑酮为13.2%(10/76)。2010年Janssen等［14］对荷兰1997年～2002年1 355例患者研究发现甲硝唑和克拉霉素原发耐药率分别为14.4%、1.0%，继发耐药率分别为43%、5.3%(继发耐药比原发耐药严重)。一项对西班牙101例儿童研究［15］发现H．pylori对甲硝唑、克拉霉素耐药率分别为35.7%、54.6%。在伊朗［16］，2005年～2008年克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮耐药率分别为7.3%、7.3%、4.5%。

1．2 随时间发展而增加 韩国首尔［17］历时16年的研究发现，1987年H．pylori对克拉霉素的耐药率为0，1994年上升至2.8%，2003年则达到13.8%。乌拉圭Torres-Debat等［18］对2001年和2006年50例患者的研究发现，H．pylori对克拉霉素耐药率平均为12%，2006年为 19%，而 2001年为 0。在意大利，De Francesco等［19］对1989年～1990年147例患者分析发现克拉霉素耐药率为10.2%，而2004年～2005年则升至21.3%。

2 噬菌体治疗耐药性幽门螺杆菌的研究

2．1 噬菌体展示技术 1985年Smith［20］首次建立噬菌体展示技术。它是一种将外源肽或蛋白与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。它将外源基因插入到噬菌体展示载体上信号肽基因和衣壳蛋白编码基因之间，从而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌体表面，被展示的外源肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。其主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体内。常用的噬菌体展示系统有丝状噬菌体系统、T4和T7噬菌体系统、λ噬菌体系统等。

2．1．1 噬菌体展示技术在H．pylori疫苗研究方面的作用:王克霞等［21］以幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)基因片段作为固相筛选分子，对噬菌体人胃细胞cDNA文库进行富集，筛选出阳性克隆后构建克隆载体，得到了幽门螺杆菌CagA基因共编码核纤层蛋白B1和胰岛素样生长因子结合蛋白2两种已知蛋白，为研究CagA致病机理及研制幽门螺杆菌疫苗等提供依据。克隆表达幽门螺杆菌基因hp0410，构建12肽噬菌体展示库，对hp0410的抗原表位进行筛选和分析，获得8个hp0410高抗原性区域的模拟表位，其中1个为模拟单抗E018特异性结合的抗原决定基的候选表位，为构建多表位嵌合疫苗提供了理论依据［22］。Li等［23］通过PCR获取H．pylori的外膜蛋白Lpp20，并作为免疫原由杂交瘤技术产生单克隆抗体，使用单克隆抗体来筛选噬菌体展示库，发现一个模拟表位在114～117氨基酸位置与Lpp20蛋白抗体良好结合，Lpp20模拟表位可用于H．pylori疫苗的开发。Houimel等［24］利用噬菌体抗体库筛选出了幽门螺杆菌尿素酶的人源单链抗体，并从肽库中筛选出与尿毒酶单链抗体相结合的6肽，这种6肽作为一种模拟表位，可用于研制幽门螺杆菌疫苗。

2．1．2 噬菌体展示技术在H．pylori单链抗体研究方面的作用:Krishnaswamy等［25］用白色念珠菌HM-1杀伤毒素单抗免疫小鼠后构建了scFv抗体库，通过竞争筛选得到1株scFv-C1阳性噬菌体抗体。实验结果提示该单抗不仅可模拟中和HM-1杀伤毒素单抗在体内的抗真菌活性，并且比该单抗对其抗原特异性结合的亲和性高出260倍。国内纪卿等［26］首次用H．pylori完整细胞通过噬菌体展示技术进行单链抗体的筛选，最终得到1株特异性表达抗H．pylori的ScFv的噬菌体JH1，为H．pylori单链抗体研究提供了新思路。

2．2 H．pylori噬菌体 噬菌体与宿主菌关系具有高度特异性，即一种噬菌体只能寄生与裂解一种与之对应的细菌。1990年Schmid等［27］首次正式报道在一株临床分离的H．pylori菌株(SchReck 290)中发现了自发产生的不同生长阶段的H．pylori噬菌体。在电镜下该成熟噬菌体的头部大小约70 nm×60 nm，尾部长至少120 nm。3年后Heintschel von Heinegg等［28］在另一项研究中发现H．pylori噬菌体能感染10株不同H．pylori菌株中的2种，并且证实其遗传物质是含有22 000个碱基对dsDNA。

2．3 噬菌体治疗耐药H．pylori展望 大量证据证明噬菌体具有有效的杀菌作用及临床疗效。Gupta等［29］报道了多价噬菌体P～27/HP可控制人类多重耐药葡萄球菌属的感染。该噬菌体可抑制60%与人类疾病相关的葡萄球菌生长。在体内实验中，皮下单独注射该噬菌体能有效保护葡萄球菌P～27/HP感染的小鼠免于死亡。Kumari等［30］有关噬菌体Kpn5治疗感染肺炎克雷白杆菌的烧伤小鼠的研究报道也证实了这一点。Cerca等［31］研究报道在使用多价抗葡萄球菌噬菌体K 24 h后仍可以有效减少表皮葡萄球菌生物膜的生物量。未来噬菌体有望通过以下几种途径治疗耐药H．pylori:①噬菌体抗菌剂。噬菌体本身具有杀菌活性，但噬菌体具有高度特异性，即使同一种细菌不同菌株，噬菌体也不同。因此筛选广谱噬菌体治疗H．pylori感染是今后研究的主要方向。② 利用噬菌体自身裂解酶。噬菌体对细菌破坏作用是通过裂解酶。③噬菌体作为抗菌药物治疗载体。直接将抗菌药物连接至噬菌体上，提高抗生素局部浓度来杀死耐药菌株的目的，或利用噬菌体将外源性致死性基因带入细菌内并表达成杀菌蛋白，在细胞内部杀死细菌［32］。

H．pylori敏感的抗生素并不多，一线治疗药物耐药菌株出现致根除率下降后人们常使用其他抗生素如呋喃唑酮、左氧氟沙星等替代，如今同样已有耐药菌株出现［33-34］。尽管仍可以开发新的靶点不同抗生素，但随着新抗生素使用，仍会有新耐药菌株的出现。而噬菌体制剂具有杀菌力强大、宿主特异性强、研制速度快等特点，使其在治疗H．pylori方面具有显著优势，有望在不久的将来成为治疗H．pylori的重要组成部分。

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