大鼠胃缺血后处理模型的建立*

马小波,杜东书,李 豫,张建福,张咏梅

1)徐州医学院生理学教研室徐州 221002 2)徐州医学院神经生物学研究中心徐州 221002

#通讯作者,男,1938年6月生,本科,教授,研究方向:消化生理,E-mail:zjf_xz@sina.com

器官缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I-R)损伤是一个重要的医学课题,如何防止或减轻I-R造成的器官损伤成为研究的关键问题。近年来有报道[1-5],采用器官的缺血后处理(ischemic postconditioning,I-postc),即器官在一个持续时间较长的缺血后,于长时间再灌注之前,实施反复多次短暂的再灌注和缺血,则可明显减轻I-R,并且已在不同动物的心肌、肢体和肝脏得到证实。但是对不同动物的不同器官制备I-postc模型,所需的最佳R-I持续时间、反复次数以及再灌注后不同时间给予的后处理均不相同。故推测不同动物的不同器官I-R损伤可能有其自身特点,建立其I-postc模型的方式也会有所不同。到目前为止,大鼠胃缺血后处理(gastric ischemic postconditioning,GI-postc)模型尚未见报道。该研究旨在建立最佳的SD大鼠GI-postc模型,为基础和临床研究提供参考,并初步探讨其保护胃黏膜的抗氧化机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2 实验动物 成年健康SD大鼠78只,体质量200～250 g,雌雄不拘,由徐州医学院实验动物中心提供。实验前禁食 24 h,自由饮水。

1.3 单纯胃缺血-再灌注(GI-R)损伤模型的制备及胃黏膜的采集 按文献[6]方法制备模型,于再灌注后 1 h处死动物,快速取胃后,沿大弯侧剪开,用冰PBS(0.1 mol/L)冲洗,计数胃黏膜损伤指数(gastricmucosal injury index,GMII)[7],以局限于胃上皮的点状糜烂和出血灶的长度累计积分:正常为0分,损伤～1 mm计1分,～2mm计 2分,～3 mm计3分,余类推;损伤宽度超过 1 mm时加倍计数,并迅速刮取胃黏膜,置于 -80℃冰箱保存备用。

1.4 动物分组及处理 假手术(Sham)组:仅行开腹,分离腹腔动脉不夹闭。GI-R组:缺血30 min,再灌注1 h。4种GI-postc模型组:夹闭腹腔动脉缺血30min后,即刻给予反复3次的再灌注10 s/缺血10 s的后处理,然后再灌注 1 h;夹闭腹腔动脉缺血 30 min后,即刻给予反复3次的再灌注20 s/缺血 20 s的后处理,然后再灌注 1 h;夹闭腹腔动脉缺血 30 min后,即刻给予反复3次的再灌注30 s/缺血 30 s的后处理,然后再灌注 1 h;夹闭腹腔动脉缺血 30 min后,即刻给予反复3次的再灌注40 s/缺血 40 s的后处理,然后再灌注1 h。不同I-R次数的GI-postc组:夹闭腹腔动脉缺血30 min,即刻分别给予反复1、3、5和 10次的再灌注 20 s/缺血 20 s的后处理,然后再灌注1 h。再灌注后的不同时间窗进行后处理组:夹闭腹腔动脉缺血 30min,移除血管夹,分别再灌注1、2和4min后,进行反复3次再灌注20 s/缺血20 s后处理,然后再灌注1 h。每组 6只大鼠。

1.5 胃黏膜SOD活性及MDA含量测定 分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥(TAB)法,严格按照说明书操作。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0对各组GMII、MDA含量和SOD活性行单因素方差分析及SNK-q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同时间的后处理对大鼠胃黏膜损伤、胃黏膜MDA含量和SOD活性的影响 结果见表1。

2.2 不同次数的GI-postc对大鼠胃黏膜损伤、胃黏膜MDA含量和SOD活性的影响 结果见表2。

2.3 再灌注后不同时间后处理对大鼠胃黏膜损伤、胃黏膜MDA含量和SOD活性的影响 结果见表3。

表1 不同再灌注和缺血时间后大鼠GM II、胃黏膜MDA含量和SOD活性比较

表2 不同次数GI-postc组大鼠GM II、胃黏膜MDA含量和SOD活性比较

表3 再灌注后不同时间进行后处理组大鼠GM II、胃黏膜MDA含量和SOD活性比较

3 讨论

器官的I-postc可有效地对抗再灌注损伤,它和缺血预处理(ischemic preconditioning,I-prec)可能都是机体内普遍存在的规律。由于I-prec需在缺血前施予,患者何时缺血难以预料,故其临床应用受限;而I-postc是在缺血后、再灌注之前施予,具有可操作性,有着更为广泛的应用价值。现有资料[3,8]表明,I-postc主要是在心肌组织进行研究的,不同种属动物的心肌I-postc的方式、方法不尽相同。

关于GI-postc模型尚无相关资料,作者发现,不同的后处理持续时间GMII组GMII与GI-R组相比,差异有统计学意义。表明该模型制备是成功的,并且以大鼠胃缺血30min后,即刻给予3个循环再灌注20 s/缺血20 s的方式减轻胃黏膜I-R损伤的效果最佳;关于后处理次数,结果显示以循环3次的效果最好;关于再灌注后何时给予后处理,结果显示在再灌注后1 min给予处理可有效地对抗损伤,当长时间的再灌注后才进行处理,则不能减轻胃黏膜损伤。这个结果与文献[8]报道一致,提示器官的 IR损伤,不仅发生在缺血的当时,更主要的是发生在恢复血流灌注后,这不能不引起人们的注意。只有抓住这个时间窗,才能有效地防治器官的I-R损伤。

胃I-R损伤和其他器官的I-R损伤一样,是一种氧化应激反应[9]。该研究初步探讨了GI-postc清除氧自由基的能力,结果表明GI-postc可降低胃黏膜组织MDA含量,增加SOD活性,说明GI-postc具有清除氧自由基能力。

综上所述,作者成功地构建了大鼠GI-postc模型,并对建模的条件进行了优化,初步探讨了I-postc对抗胃黏膜I-R损伤的抗氧化机制,为基础和临床的研究提供了参考。

[1]Zhao ZQ,Corvera JS,HalkosME,etal.Inhibition ofmyocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol HeartCirc Physiol,2003,285(2):H 579

[2]Sun K,Liu ZS,Sun Q.Role ofm itochondria in cell apoptosis during hepatic ischem ia-reperfusion injury and protective effectof ischemic postconditioning[J].World JGastroenterol,2004,10(13):1934

[3]Iliod romitis EK,Georgiadis M,Cohn MV,et al.Protection from postconditioning depends on the number of short ischem ic insults in anesthetized pigs[J].Basic Res Cardiol,2006,101(6):502

[4]刘兴德,袁志柳,黄达枚,等.双下肢缺血后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].贵阳医学院学报,2004,29(1):7

[5]Yang XM,Proctor JB,Cui L,et al.Multiple,brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J].JAm Coll Cardiol,2004,44(5):1103

[6]LI L,Zhang YM,Qiao WL,et al.Role ofm itogen-activated protein kinases in the regulation of paraventricular nucleus to gastric ischemia-reperfusion injuries[J].Chin Med J,2007,120(12):1082

[7]Zhang JF,Zhang YM,Yan CD,etal.Neroregulativemechanism of hypothalamic paraventricu lar nucleus on gastric ischem ia-reperfusion injury in rats[J].Life Sci,2002,71 (13):1501

[8]Kin H,Zhao ZQ,Sun HY,et al.Postconditioning attenuatesmyocardial ischemia reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion[J].Cardiovasc Res,2004,62(1):74

[9]Hoffman JW Jr,Gilbert TB,Poston RS,etal.Myocardial reperfusion injury:etiology,mechanisms,and therapies [J].JExtra Corpor Technol,2004,36(4):391