RNA干扰对MCF-7细胞eIF4E表达的影响*

崔 莹,孙淼淼,崔 黎,张 威,周 强,陈奎生#

1)郑州大学第一附属医院病理科;河南省肿瘤病理重点实验室郑州 450052 2)郑州市卫生学校病理学教研室郑州 450005 3)河南省肿瘤医院病理科郑州 450003

#通讯作者,男,1964年3月生,博士,教授,研究方向:肿瘤病理,E-mail:chenksh2002@yahoo.com.cn

真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)是真核细胞翻译水平上的重要调节因子,在人类多种肿瘤(头颈部鳞状细胞癌、乳癌及胃癌等)组织中常呈现高表达状态,促进肿瘤的生长和侵袭转移[1]。RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是由双链RNA介导的内源性基因沉默,可在mRNA水平上关闭相关基因的表达。作为一种新兴的基因治疗技术,RNAi不仅成为分析人类基因组功能的有力工具,而且为肿瘤病因、免疫机制及基因治疗等方面的研究开拓了广阔的发展前景[2]。RNAi技术以其简单快速、特异性高的特点,已被广泛应用于恶性肿瘤的基因功能研究和基因治疗等领域,与传统的肿瘤治疗方法相比,其针对性更强,毒副作用更小[3]。作者观察了RNAi技术体外对乳癌MCF-7细胞中eIF4E基因表达的影响,为应用RNAi技术靶向治疗乳癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 MCF-7细胞系由河南省医药科学研究所王庆端研究员惠赠。RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司,T7 RiboMAXTMExpress RNAi System、SA-AP及BCIP/NBT购自美国Promega公司,脂质体购自上海杰美基因医药科技有限公司,免疫组化SP试剂盒、胃蛋白酶及预杂交液购于武汉博士德生物工程有限公司,鼠抗人eIF4E多克隆抗体购于Santa Cruz公司,小分子干扰RNA(siRNA)模板及eIF4E cDNA探针(5'-CTAGCCAAAA GCGATCGAGG-3')由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.2 靶向eIF4E siRNA的设计与合成 针对eIF4E基因的作用位点设计合成DNA模板,按T7 RiboMAX Express RNAiSystem转录说明进行转录,得到目的siRNA。无关模板按如上操作得到无关siRNA。

1.3 靶向eIF4E siRNA的转染 将MCF-7细胞置于RPMI 1640培养液(含青霉素、链霉素各100 U/ m L和体积分数10%胎牛血清)中,在37℃、体积分数5%的CO2培养箱内贴壁培养。选取对数生长期细胞,按(2～6)×106/孔接种于 6孔培养板内分组培养。分组培养 24 h后进行脂质体介导的转染。实验分组包括不同质量浓度(100、150和 200mg/ L)siRNA转染组、正常对照组(不进行转染)、空白对照组(转染时只加脂质体)和无关对照组(转染150mg/L无关siRNA)。转染24、48和72 h后,收集并调整细胞浓度为 106m L-1,将细胞滴于预处理的载玻片上固定,4℃冰箱保存备用。

1.4 MCF-7细胞eIF4E蛋白的检测 采用免疫细胞化学法。操作步骤严格按试剂盒说明书进行, eIF4E一抗工作浓度1∶100,DAB显色,中性树胶封固。以PBS代替一抗作阴性对照,用已知eIF4E蛋白阳性表达的乳癌组织作阳性对照[2]。均重复5次。

1.5 MCF-7细胞eIF4E m RNA的检测 采用原位杂交法,操作严格按试剂说明书进行。以杂交前用RNase处理的样本作阴性对照,用已知的eIF4E mRNA阳性表达的乳癌组织作阳性对照[4]。均重复5次。

1.6 结果判定 eIF4E蛋白免疫细胞化学染色阳性信号位于胞质内,呈棕黄色;eIF4E mRNA原位杂交阳性信号位于胞质内,呈蓝紫色。每张滴片选取10个高倍视野,按阳性细胞百分比及着色深浅进行结果判定[5]。①阳性细胞百分比计分:＜1%为 0分,1%～为 1分,26%～为 2分,51%～为 3分, 76%～为 4分。②细胞着色强度计分:显色为 0分,淡黄或淡蓝色为 1分,棕黄或深蓝色为2分,棕褐或蓝紫色为 3分。2项得分之积为最终得分。

1.7 统计学处理 应用SPSS 13.0进行统计分析, 6组间及不同时间点间eIF4E蛋白及mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析及LSD-t检验;检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MCF-7细胞形态的变化 各siRNA转染组MCF-7细胞大部分体积缩小,部分细胞皱缩、漂浮。2.2 MCF-T细胞eIF4E蛋白及m RNA的表达

见表 1、2和图 1、2。

表1 各组细胞eIF4E蛋白的表达(n=5)

表2 各组细胞eIF4E mRNA的表达(n=5)

3 讨论

eIF4E是近年来发现的一种重要的原癌基因,其过度表达能促进细胞的增殖以及细胞的恶性转化[6]。Soni等[7]发现,降低乳癌细胞中eIF4E的表达,癌细胞的生长将明显受抑制。因此,eIF4E基因有望成为肿瘤治疗的新靶点。

动物实验[8]证实采用RNAi技术抑制eIF4E基因的表达可有效抑制移植瘤组织的生长,提示运用RNAi技术针对eIF4E基因进行肿瘤的基因治疗具有一定的可行性。作者应用RNAi技术,针对eIF4E基因的特异性结合位点体外转录合成特异性siRNA,并以不同浓度转染乳癌 MCF-7细胞。结果表明:随着eIF4E siRNA转染浓度和时间的增加, MCF-7细胞生长受到抑制,eIF4E蛋白及mRNA的表达较对照组显著下降。进一步证实eIF4E siRNA可有效抑制 eIF4E癌基因的表达,为临床应用eIF4E siRNA特异性治疗乳癌提供了实验依据。

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