表皮生长因子受体抑制剂对外源锌离子致大鼠急性呼吸道炎症的影响*

贾陈志,关文池,李 冰,梁 宁,燕 贞,王 威,吴逸明,吴卫东#

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州 450001 2)厦门大学医学院临床医学系厦门 361005

#通讯作者,男,1963年10月生,博士,教授,研究方向:分子毒理学,E-mail:wdwu98@gmail.com

大气中锌离子主要存在于微细颗粒物中,可以多种形式存在,主要包括硫酸锌、氧化锌和氯化锌。环境流行病学调查结果[1-2]表明,长期吸入空气中含锌颗粒物与当地居民呼吸系统炎症性疾病(如慢性支气管炎、支气管哮喘)发病率的升高有密切关系。实验结果[3]显示,含锌化合物可提高人支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞内白细胞介素8(interleukin-8, IL-8)的表达。发生肺部炎症的大鼠支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)中中性粒细胞、巨噬细胞和总蛋白含量升高[4]。外源锌离子可激活呼吸道上皮细胞内多个信号传导分子,如表皮生长因子受体(epidermal growth factor recep tor, EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B, PI3K-PKB)等[5]。但是这些信号传导分子在锌离子致呼吸道损伤过程中的作用还不清楚。课题组前期研究[6]观察到外源性锌离子有磷酸化(即活化)人呼吸道上皮细胞EGFR作用,因此推断EGFR可能在锌离子致呼吸道炎症过程中发挥重要作用。为证实推论,作者进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 试剂 硫酸锌(天津凯通化学试剂有限公司),EGFR抑制剂PD153035(美国Calbiochem公司),二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司),IL-8、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、ELISA试剂盒(美国RD Biosciences公司)。

1.2 实验分组 实验对象:13周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠50只,体质量100～130 g,购自河南省实验动物中心,合格证号scxk(豫)2005-0001。实验分两个阶段。第一阶段探讨硫酸锌引起大鼠急性呼吸道炎症最明显的时间点。30只大鼠采用随机数字表分为 6组,每组 5只,大鼠先用乙醚麻醉,然后采用支气管灌注法分别给予PBS或100μmol/L硫酸锌溶液(灌注剂量1m L/kg),分别于灌注后4、8、24 h处死。第二阶段探讨预灌注PD153035对硫酸锌作用的影响。20只大鼠随机分为4组(分别用PD153035和硫酸锌、PD153035和PBS、DMSO和硫酸锌以及DMSO和PBS灌注处理),每组5只,先用DMSO或1 μmol/L PD153035溶液预灌注,灌注剂量0.5m L/kg,约30min后再按照同样方法分别灌注PBS和硫酸锌溶液。处理时间参考第一阶段实验结果。

1.3 呼吸道炎症指标检测方法 大鼠颈椎脱臼处死,每只用5m L生理盐水进行肺灌洗2次,取BALF混匀,先进行白细胞计数,然后2 000 r/m in离心10 min,取上清液用于总蛋白(考马斯亮蓝法)、IL-8蛋白和LDH含量检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0进行分析。应用 2×3析因设计方差分析,比较不同灌注液及时间对大鼠急性呼吸道炎症的影响,筛选最佳时间;应用2×2析因设计方差分析,比较预灌注液和灌注液的主效应及其交互作用。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 硫酸锌对大鼠呼吸道各炎症指标的影响 见表1。灌注硫酸锌8 h时各炎症指标均高于4 h和24 h。

2.2 EGFR抑制剂对硫酸锌致大鼠呼吸道炎症指标的影响 见表2。

表1 硫酸锌对大鼠呼吸道各炎症指标的影响(n=5)

表2 EGFR抑制剂对硫酸锌致大鼠呼吸道炎症指标的影响(n=5)

3 讨论

EGFR广泛分布于上皮组织中,参与呼吸道上皮细胞膜的修复等生理反应,在呼吸道炎症发生过程中起重要调节作用[7],另外在肺癌组织中大量表达[8]。PD153035是EGFR酪氨酸激酶的特异性抑制剂,能选择性地阻止 EGF介导的细胞有丝分裂、基因表达和细胞癌变[9]。

为阐明EGFR抑制剂对锌离子诱发呼吸道炎症的影响,研究者先制备大鼠呼吸道炎症模型。由于硫酸盐在细胞代谢和哺乳动物的发育过程中起重要作用,硫酸根离子维持着机体的酸碱平衡[10],且硫酸锌是锌离子在空气颗粒物中主要的存在形式,因此研究者使用气管灌注硫酸锌的方法诱发动物呼吸道炎症。结果显示,BALF中各指标均较对照组明显升高,以灌注 8 h最明显,提示硫酸锌可诱发大鼠急性呼吸道炎症。

进一步用EGFR抑制剂PD153035(溶解于DMSO)预灌注大鼠呼吸道,并用DMSO为对照,在灌注硫酸锌和PBS 8 h后观察炎症变化。研究结果显示PD153035预灌注组各炎症指标均比DMSO预灌注组减弱,提示 PD153035可明显抑制硫酸锌对大鼠呼吸道的炎性损伤作用。至于硫酸锌是通过何种机制激活EGFR以及EGFR又是通过何种机制介导硫酸锌的炎症作用,尚有待深入研究。

综上所述,呼吸道灌注硫酸锌可诱发大鼠呼吸道急性炎症,EGFR抑制剂PD153035能够有效抑制硫酸锌诱发的呼吸道急性炎症。

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