饲粮硒对种公鸡睾丸中硒含量和硒蛋白酶基因 mRNA表达的影响

赵 庆 刘爱巧 王晓霞 张 洁 刘亭婷

(1.北京农学院动物科学技术学院,北京 102206;2.北京华都峪口禽业有限公司,北京 101206;3.首都师范大学,北京 100048;4.北京农业职业技术学院畜牧兽医系,北京 102442)

硒是动物必需的一种微量元素,对维持机体生命活动及生长发育必不可少。硒以硒半胱氨酸形式通过 UGA密码子编码形成硒蛋白,与机体的抗氧化作用、免疫应答及内分泌功能密切相关,直接影响动物的生长、发育和繁殖[1]。对雄性动物的研究发现,以硒半胱氨酸为中心的抗氧化酶系能消除体内代谢过程产生的过多的自由基,促进睾丸发育,提高精液品质[2-3]。硒缺乏会导致硒蛋白酶活性的显著降低,其中包括硫氧还蛋白还原酶家族(TrxRs)、谷胱甘肽过氧化物酶家族(GPxs)和脱碘酶家族(IDs)。然而,在硒缺乏和充足时,硒蛋白的表达呈现出等级现象,在特定器官中根据某种硒蛋白的重要性可以决定其基因mRNA的相对表达水平和蛋白表达的优先性[4]。在硒缺乏的情况下,肝、肾和肺中的大部分硒蛋白酶活性下降,而在大脑中的硒蛋白酶活性仍然处在一个正常硒供给情况下的水平。当然硒过量也会引起动物中毒,在生产中需按照“适量为必须,超量则中毒”的原则添加。种公鸡营养状况、饲养管理水平以及人工授精技术等均会影响其精液品质和繁殖性能,但是有关种公鸡的营养研究报道较少。关于饲粮中添加硒对种公鸡睾丸组织生理功能的影响,其硒的吸收与硒蛋白酶基因 mRNA相对表达水平的关系如何,目前鲜见报道。本文旨在通过对海兰褐种公鸡饲粮进行不同来源和水平的硒处理,研究饲粮硒对种公鸡睾丸组织硒沉积和硒蛋白酶基因 mRNA相对表达水平的影响以及二者之间的关系,为进一步研究其分子机理及指导生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

亚硒酸钠(sodium selenite,SS)购自黄骅市津华添加剂有限公司,硒含量为 44.7%;酵母硒(selenium yeast,SY)购自安琪酵母股份有限公司,硒含量为 2 000 mg/kg。Trizol购自 Invitrogen公司,Depc购自 Sigma公司,逆转录试剂盒(M-MLV)购自 Invitrogen公司,Real-time试剂盒购自 Takara公司。硝酸、盐酸、过氯酸和氢溴酸均为国产分析纯。

1.2 试验设计与饲粮

2010年 3月于北京农业职业技术学院种鸡场选取 224只 48周龄海兰褐蛋用种公鸡为试验动物,平均体重为(3 000.14±123.71)g,随机分为7个处理,每个处理 4个重复,每个重复 8只,单笼饲养。将 SY和 SS 2种硒源分别以 0.2、0.5和0.8mg/kg 3个硒水平添加到种公鸡基础饲粮中,所有组均饲喂基础饲粮 1周后,开始饲喂相应的试验饲粮(对照组饲喂基础饲粮),正试期 35 d。依照海兰褐蛋用种公鸡饲养管理规程进行饲养管理,自由饮水和人工喂料,每天按规程要求清扫地面、粪便和带鸡喷雾消毒。整个试验在北京农业职业技术学院种鸡场进行。于试验第 35天,每个重复随机取 1只鸡翅静脉采血,制备血浆,并于试验结束后,每个重复随机取 1只鸡宰杀,取其睾丸样。

本试验采用玉米 -豆粕型饲粮,参考美国NRC(1994)禽类营养标准配制。基础饲粮组成及营养水平见表 1。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.3 睾丸中硒含量的测定

睾丸中硒含量按照 GB/T 12399—1996硒含量测定方法测定。

1.4 血浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的测定

使用南京建成工程研究所提供的试剂盒测定血浆中 GPx活性。

1.5 睾丸中硒蛋白酶基因 m RNA相对表达水平的测定

1.5.1 引物设计与合成

根据 GenBank公布的鸡基因序列设计引物见表2,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

表 2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-PCR

1.5.2 实时荧光定量 PCR(RT-PCR)

睾丸组织总 RNA提取采用 Trizol法,对所提取 RNA进行检测,以 OD260/OD280和OD260/OD230值判断 RNA样品中有无污染,以甘油醛 -3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为相对定量内参,按照 M-MLV逆转录试剂盒合成 cDNA第 1链,PCR使用条件为：预变性 94℃ 10 s,变性 94℃ 5 s,退火 /延伸60℃ 34 s,共 40个重复。采用 2-△△Ct法分析碘化甲腺氨酸脱碘酶 1(ID1)、磷脂谷胱甘肽过氧化物酶(GPx4)和硫氧还蛋白还原酶 2(TrxR2)基因mRNA相对表达水平。

1.6 数据处理及统计分析

试验数据均以平均值 ±标准差表示,应用SPSS 16.0软件进行统计分析,差异显著者用 Oneway ANOVA比较各组间相关指标的差异;用Two-way ANOVA检验硒源和硒水平对睾丸硒沉积的主效应及两者间的交互效应。

2 结 果

2.1 RNA凝胶电泳

图 1是 RNA提取后的琼脂糖凝胶电泳图,由此图可以看出,5S、18S和 28S条带明显,这说明提取的 RNA的完整性良好,可以用来进行反转录和 PCR的扩增。

2.2 饲粮硒源和硒水平对种公鸡睾丸中硒含量的影响

由表 3可见,硒源和硒水平对种公鸡睾丸中硒含量均有显著影响(P＜0.01),而硒源和硒水平之间的交互作用对睾丸中硒含量没有显著影响(P＞0.05)。添加 SS的组和添加 SY的组种公鸡的睾丸中硒含量分别较对照组高 19.38%(P＜0.01)和 28.29%(P＜0.01),且添加 SY的组种公鸡的睾丸中硒含量较添加 SS的组高 7.47%(P＜0.01)。

图 1 总 RNA凝胶电泳结果Fig.1 Electrophoresis resultof total RNA sam ple

2.3 饲粮硒源和硒水平对种公鸡血浆中 GPx活性的影响

表 4表明,与对照组相比,0.5 mg/kg SS组种公鸡血浆中 GPx活性提高了 9.80%(P＜0.05),0.5 mg/kg SY组和 0.8 mg/kg SY组种公鸡血浆中 GPx活性分别提高了 11.67%(P＜0.05)和16.98%(P＜0.05)。

2.4 饲粮硒源和硒水平对种公鸡睾丸中硒蛋白酶基因m RNA相对表达水平的影响

RT-PCR方法研究 ID1、GPx4和 TrxR2基因mRNA相对表达水平,结果见表 5。

各组种公鸡睾丸中 ID1基因 mRNA相对表达水平差异均不显著(P＞0.05)。

关于种公鸡睾丸中 GPx4基因 mRNA相对表达水平,以 SS为硒源时,3个水平组均显著高于对照组,分别提高了 1.36%(P＜0.01)、13.33%(P＜0.01)和 8.34%(P＜0.01),但 3组之间差异不显著(P＞0.05);以 SY为硒源时,3个水平组均显著高于对照组,分别提高了 11.06%(P＜0.01)、15.41%(P＜0.01)和 19.95%(P＜0.01),且0.8 mg/kg SY组比 0.2 mg/kg SY组高8.00%(P＜0.01)。

表 3 饲粮硒源和硒水平对种公鸡睾丸中硒含量的影响Table 3 Effects of dietary selenium source and level on selenium content in the testis of breeder cocks mg/kg

表 4 饲粮硒源和硒水平对种公鸡血浆中GPx活性的影响Table 4 Effects of dietary selenium source and levelon GPx activity in the p lasma of breeder cocks

关于种公鸡睾丸中 TrxR2基因 m RNA相对表达水平,以 SS为硒源时,3个水平组均显著高于对照组,分别提高了 15.49%(P＜0.01)、19.39%(P＜0.01)和 21.24%(P＜0.01),且 0.8 mg/kg SS组比 0.2mg/kg SS组高 4.98%(P＜0.05);以SY为硒源时,3个水平组均显著高于对照组,分别提高了 17.16%(P＜0.01)、19.94%(P＜0.01)和 23.84%(P＜0.01),且 0.8 mg/kg SY组比0.2 mg/kg SY组高 5.70%(P＜0.01)。

3 讨 论

微量元素硒有无机硒和有机硒 2种形式,通常情况下组织更容易吸收有机硒,无机硒被组织吸收很少[5]。生产中为了满足畜禽对硒的需要量,通常在饲粮中添加一定量的外源硒。组织硒沉积依赖于组织特异性、食物中有效硒含量、饲喂时间长短、动物品种和年龄及硒的化学形式。本试验结果表明,饲粮中添加 SS和 SY均能显著提高睾丸组织硒沉积,且 SY处理显著优于 SS处理。说明有机硒的机体利用率高于无机硒,这与Danny[6]以 SY形式向母猪饲粮中添加有机硒的结果一致,以 SY形式提供的硒的生物学利用率高于SS形式提供的硒。

表 5 饲粮硒源和硒水平对种公鸡睾丸中硒蛋白酶基因 mRNA相对表达水平的影响Table 5 Effects of dietary selenium source and levelon the mRNA relative expression levelof selenium protease gene in the testis of breeder cocks

GPx是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,是反映机体抗氧化能力的重要指标。本研究发现,对于提高种公鸡血浆中 GPx活性,饲粮中添加 SY较添加 SS的效果更显著。这与占秀安等[7]的有机硒(硒代蛋氨酸)对母猪抗氧化指标影响的研究结果是一致的,有机硒生物学效率优于无机硒。但 Manhan等[8]在育肥猪上的研究表明,添加 SS较添加 SY能显著提高血清中 GPx活性。推测这可能与动物种属和性别等原因有关。本试验表明有机硒可能更利于硒在种公鸡体内被转化利用。

微量元素硒与雄性动物生殖器官有很强的亲和性,并依赖其机体主要存在形式硒蛋白发挥其生物学功能。Smith等[9]用放射性同位素的方法研究测定了公牛多种器官中硒的分布状况,发现除肾外,以睾丸、附睾、前列腺、精囊腺组织中的含量最高,这表明硒与动物生殖密切相关。IDs是一类细胞膜硒蛋白酶,主要功能是调节机体甲状腺激素的水平。Beckett等[10]发现大鼠营养性硒缺乏导致血浆三碘甲腺原氨酸(T3)水平显著下降、四碘甲腺原氨酸(T4)水平显著升高和肝脏 ID1活性显著下降。原位杂交法表明 GPx4在末期精细胞中丰富表达[11]。Ursini等[12]研究 GPx4在精子发育的早期具有酶活性,而在精子成熟期则聚合变构转变成一种结构成分,维持精子正常的形态和活力。这表明 GPx4在精子发育成熟和活力维持中具有酶功能和结构作用的双重性。TrxR可清除过氧化氢和脂质过氧化物,其清除效率甚至高于 GPx,对维持细胞内还原状态非常重要。这表明饲粮硒通过机体合成硒蛋白酶,后者在体内发挥重要的生理功能。在哺乳动物细胞中,控制mRNA的相对表达水平是调控蛋白生成的关键因素。关于硒蛋白酶基因的表达,体内硒含量是其重要的调控因素。硒的营养状况可影响硒蛋白酶生成量及其基因 mRNA的相对表达水平[13]。Diane等[14]的研究结果显示,缺硒能使大鼠肾脏 ID1基因 mRNA的相对表达水平降低 40%,而对肝脏ID 1基因 mRNA的相对表达水平没有影响;但潘翠玲[15]研究发现富硒益生菌能够显著提高蛋鸡肝脏组织中 ID1基因 m RNA的相对表达水平;本试验添加硒对种公鸡睾丸组织中 ID1基因 mRNA的相对表达水平没有显著影响。以上结果表明,硒对组织中 ID1基因 mRNA的表达存在组织差异性和种属特异性,可能还与其他一些未知的因素有关,有待于进一步研究。X in等[16]和 Kevin等[17]研究了不同硒水平的 SS对大鼠肝脏 GPx1基因mRNA表达的影响,结果表明不同硒水平不影响GPx1基因 mRNA的生成量,但影响 mRNA的稳定性,大鼠体内硒缺乏时,GPx1基因 m RNA稳定性降低,GPx1基因 mRNA的相对表达水平也随之降低。X in等[18]用添加0.3 mg/kg硒的饲粮饲喂猪,结果表明猪的肝脏和睾丸中的 GPx4活性变化规律是一致的：对睾丸组织而言,1日龄和 28日龄时的 GPx4基因 mRNA相对表达水平显著地小于180日龄;对肝脏组织而言,28日龄和 180日龄时的 GPx4基因 m RNA相对表达水平没有显著差异,但都显著地大于 1日龄时GPx4基因 mRNA的相对表达水平。Lei等[19]将大鼠饲粮中硒水平由2μg/kg上升到 190μg/kg时,睾丸中 GPx4基因mRNA的相对表达水平不受饲粮硒水平的影响。关于 GPx4基因 mRNA的相对表达水平报道不一致的原因,推测可能是动物硒蛋白酶基因的表达可能存在组织和时间的差异性,其作用机制有待于进一步探讨。本试验结果显示,以 SS为硒源时,不同添加水平的 SS组显著高于对照组,但各水平组之间 GPx4基因 mRNA的相对表达水平差异不显著,且当添加水平为 0.8 mg/kg时,其相对表达水平有下降趋势;以 SY为硒源时,不同添加水平的 SY组 GPx4基因 mRNA的相对表达水平显著高于对照组,且0.8mg/kg组显著高于0.2 mg/kg组。这与上述等研究结果不一致,可能是种公鸡睾丸组织中 GPx4基因 mRNA的相对表达水平与不同硒源和水平有关,也与种属特异性有关。Jurado等[20]检测百草枯应激小鼠不同组织中 TrxR基因 mRNA的相对表达水平时发现,其睾丸、脾和肾组织中 TrxR基因 mRNA相对表达水平均有不程度提高,其中睾丸中显著提高。但是TrxR基因 mRNA的相对表达水平的提高不一定是 TrxR蛋白水平提高的直接信号。本试验研究饲粮添加硒对种公鸡睾丸组织中 TrxR 2基因mRNA相对表达水平的影响,其规律与本试验研究结果的饲粮添加硒对睾丸组织中 GPx4基因mRNA相对表达水平的影响基本一致,结果表明饲粮中添加硒可以显著提高睾丸组织中 TrxR2基因m RNA的相对表达水平。有关硒蛋白酶在睾丸组织中的相对表达水平和活性与硒蛋白酶基因m RNA的相对表达水平的关系有待进一步研究。

4 结 论

在本试验条件下,饲粮中添加 SY可增强种公鸡抗氧化功能,添加 0.8 mg/kg SY效果较好。

[1] RAYMAN M P.The im portance of selenium to human health[J].The Lancet,2000,356(9225)：233-241.

[2] JONESR,MANN T.Lipid peroxidation in spermatozona[J].Proceedings o f the Royal Society：Biology Science,1973,184：103-107.

[3] MARK EW,KEV IN JR,THOMAS D C.Boar nutrition for optimum sperm production[J].Advances in Pork Production,2004,15：295-305.

[4] FLOHE L,AANDREESEN JR,MAIORINO M,et al.selenium,the element of the moon,in life on earth[J].IUBMB life,2000,49(5)：411-420.

[5] WOLFRAM S.Biotechnology in feed industry[M].Nottingham： Nottingham University Press,1999：547-566.

[6] DANNY M H.Organic selenium m ay aid sow s,prew ean pigs[J].Feedstuffs,2006,78：12-13.

[7] 占秀安,李星,赵茹茜,等.日粮添加硒代蛋氨酸对母猪生产性能、血清及乳中含量和抗氧化指标的影响[J].动物营养学报,2009,21(6)：910-915.

[8] MANHAN D C,CLINE T R,RICHERT B.Effects of dietary levels o f selenium-enriched yeast and sodium selenite as selenium sources fed to growing-finishing pigs on performance,tissue selenium,serum glutathione peroxidase activity,carcass characteristics,and loin quality[J].Journal o f Animal Science,1999,77(8)：2172-2179.

[9] SM ITH O B,AK INBAM IJO O O.M icronutrients and reproduction in farm animals[J].Animal Rep roduction Science,2000(60/61)：549-560.

[10] BECKETT G J,N IEOL F,RAE PW,et al.Effects of combined iodineand selenium deficiency on thy roid hormonemetabolism in rats[J].American Journal of Clinical Nutrition,1993,57(Supp l.)：240-243.

[11] NAM S Y,FUJISAWA M,KIM JS,etal.Exp ression pattern of phospho lipid hydroperoxide g lutathione peroxidasemessenger ribonucleic acid in mouse testis[J].Bio loghical Rep roduction,1998,58：1272-1276.

[12] URSIN IF,MA IORINO M,GREGOLIN C.The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide g lutathione peroxidase[J].Biochim ica et Biophysica Acta,1985,839：62-70.

[13] BURK F R,H ILL K E.Regulation of selenoproteins[J].Annual Review of Nutrition,1993,13：65-81.

[14] DIANED,K INLAW W B,ZHAO C.Effectof selenium deficiency on typeⅠ5'-deiodinase[J].Journal of Biological Chem istry,1994,269(23)：16223-16228.

[15] 潘翠玲.有机硒源在蛋鸡生产中的应用及其机理研究[D].博士学位论文.南京：南京农业大学,2008.

[16] XIN G L,EVENSON JK,SUNDER A,etal.G lutathione peroxidase and phospho lipid hydroperoxide glutathione peroxidase are differentially regulated in rats by dietary selenium[J].Journal o f Nutrition,1995,125：1438-1446.

[17] KEVIN B H,ROGER A S.Selenium regu lation o f thioredoxin reductase activity and mRNA levels in rat liver[J].Journal of Nutritional Biochem ist,2001,12：693-702.

[18] XIN G L,DEBORAH A R,KARL R R.Comparison o f age-related differences in expression of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA and activity in various tissues of pigs[J].Comparative Biochem istry and Physio logy,1997,117(1)：109-114.

[19] LEIX G,EVENSON JK,THOMPSON K M,etal.G lutathione peroxidase and phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase are differentially regu lated in rats by dietary selenium[J].The Journalof Nutrition,1995,125：1438-1446.

[20] JURADO JM,MADRID R J,PUEYO C.Absolute gene expression patterns of thioredoxin and g lutaredoxin redox systems inmouse[J].Journal o f Biological Chem istry,2003,278：45546-45554.