谷氨酸和谷氨酰胺转运系统的研究进展

王秋菊 许 丽＊ 范明哲

(1.东北农业大学动物科技学院动物营养与饲料系,哈尔滨 150030;2.圭尔夫大学安大略农业学院动物与家禽科学系,圭尔夫 N 1G 2W 1,加拿大)

谷氨酸(Glu)作为动物黏膜主要的能源物质之一,可以氧化供能,为动物机体提供能量,是肠内能量生成的最大贡献者[1],是与肠黏膜生长和代谢相关的重要氨基酸之一[2],对幼畜的生长发育尤为重要。谷氨酸可作为氨基酸合成的前体物、其他氨基酸分解代谢或蛋白质从头合成所需的 α-氨基和氨氮的碳受体,并可维持机体的氮平衡[3]。谷氨酸与半胱氨酸及甘氨酸均为合成谷胱甘肽的底物[4],为动物肠道提供抗氧化剂。另外,谷氨酸还可作为兴奋性氨基酸神经递质在哺乳动物的神经系统中起作用[5]。谷氨酰胺(Gln)是哺乳动物血浆和母猪乳汁中一种含量非常丰富的游离氨基酸,也是动物肠黏膜主要的能源物质。谷氨酰胺对肠黏膜具有保护作用,能增加肠道的血流量和氧耗量,对缺血缺氧造成的肠黏膜物理屏障损伤具有一定的修复功能;在完全胃肠外营养输液期间,谷氨酰胺可以被磷酸激活的谷氨酰胺酶水解为谷氨酸和氨,是谷氨酸的主要来源,为还原型谷胱甘肽合成提供前体,对机体抗氧化剂的合成起重要作用。谷氨酸和谷氨酰胺的转运对维持机体内谷氨酸的含量尤其重要,因此,本文就谷氨酸和谷氨酰胺转运系统的分类及作用机制做一综述。

1 谷氨酸和谷氨酰胺转运系统分类

氨基酸转运系统广泛存在于机体中,按照转运氨基酸的性质可以分为中性、碱性和酸性氨基酸转运载体;按照转运是否依赖 Na+可以分为Na+依赖氨基酸转运载体和非 Na+依赖氨基酸转运载体;按照氨基酸转运载体的底物特异性、亲和力和转运特点可以分为 XAG-、XC-、y+、A、ASC、B0、B0,+、L、N、b和 y+L转运系统。 XAG-转运系统包括 5种高亲和力的氨基酸转运载体,分别为谷氨酸 -天冬氨酸转运载体(GLAST)或称为兴奋性氨基酸转运载体 1(EAAT1)、谷氨酸转运载体 -1(GLT-1)或称为兴奋性氨基酸转运载体 2(EAAT2)、兴奋性氨基酸载体 1(EAAC1)或称为兴奋性氨基酸转运载体 3(EAAT3)以及兴奋性氨基酸转运载体 4(EAAT4)和兴奋性氨基酸转运载体 5(EAAT5)[6];ASC转运系统包括 2种中性氨基酸转运载体,分别为中性氨基酸转运载体 1(ASCT1)和中性氨基酸转运载体 2(ASCT2)或称为谷氨酰胺转运载体。XAG-和 ASC转运系统均属于溶质载体 1(SLC1)家族,GLAST、GLT-1、EAAC1、EAAT4和 EAAT5也可分别表示为SLC1A 1、SLC1A2、SLC1A 3、SLC1A6和 SLC1A7;ASCT1和 ASCT2也可分别表示为 SLC1A 4和SLC1A 5。尽管这些转运载体之间具有相似的可预测结构(同源性),但转运机制的不同使它们表现出不同的功能[7]。

高亲和力的谷氨酸转运载体可以介导谷氨酸和胱氨酸的转运,同时与 3个 Na+和 1个 H+的正向转运及 1个K+的逆向转运相偶联,而 ASC转运载体可以介导依赖 Na+变化的小分子中性氨基酸的转运,如谷氨酰胺和天冬酰胺等。谷氨酸转运载体的偶联方式允许逆谷氨酸浓度梯度转运谷氨酸到细胞内[6]。

1.1 谷氨酸转运系统分类

谷氨酸转运系统有 XAG-和XC-系统,如图 1所示。谷氨酸转运的首要途径是通过高亲和力的XAG-转运系统[8],依赖 Na+从细胞外转运谷氨酸入细胞内来完成的;XC-转运系统为谷氨酸 -胱氨酸交换介导系统,通过将谷氨酸转运出细胞外置换胱氨酸进入细胞[9],为非 Na+依赖系统。

谷氨酸的摄取除了依靠其转运载体直接从细胞外转运外,还可以以谷氨酰胺为前体物,通过谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺合成谷氨酸[4]。

图 1 谷氨酸的转运Fig.1 Transportation of g lutamate[10]

1.2 谷氨酰胺转运系统分类

谷氨酰胺转运系统包括 A、N、y+L、ASC、B0、L和 b转运系统。前 5种转运系统为 Na+依赖转运系统,转运过程需要 Na+/K+和 ATP提供能量,进行谷氨酰胺的转运;后 2种转运系统转运谷氨酰胺过程不需要 Na+参与[11]。Na+依赖转运是谷氨酰胺转运的主要转运方式[12],其中 ASC和 B0转运系统是近些年的研究热点,而 ASC转运系统中的 ASCT2是高亲和力的转运谷氨酰胺的载体,表达最强,对谷氨酰胺转运起重要作用,还可以少量转运谷氨酸。

表 1归纳了谷氨酸和谷氨酰胺转运系统载体的种类、组织分布、底物特异性及离子依赖等特点。

表 1 谷氨酸和谷氨酰胺转运载体的种类、组织分布、底物特异性、亲和力和离子依赖Table 1 Category,tissue disposition,substrate specificity,affinity and ion rely of glutamate and glutam ine transporters

2 谷氨酸和谷氨酰胺转运系统及主要载体特点

2.1 XAG-转运系统

2.1.1 XAG-转运系统分类及特点Na+依赖的兴奋性氨基酸转运载体或谷氨酸转运载体可以调节中枢神经系统细胞内外谷氨酸的转运,并调节细胞外谷氨酸的浓度,属于 X-AG转运系统。XAG-转运系统可以发挥转运载体和离子通道的作用[18]。Na+依赖谷氨酸转运是一个生物电传导的过程[19],包括 2个不同的半循环过程：1个谷氨酸和 3个 Na+、1个 H+结合,结合位点转向将谷氨酸运送到细胞内;同时伴随 K+释放到细胞外[20],这个过程可表示为 3Na+∶1H+∶1K+∶1谷氨酸。

目前已证实有 5种兴奋性氨基酸转运载体,分 别 是 GLAST、GLT-1、EAAC1、EAAT4和EAAT5[14]。星形胶质细胞主要表达 GLAST和GLT-1,神经系统主要表达 EAAC1、EAAT4和EAAT5,EAAT4只能在小脑浦肯野细胞表达,视网膜表达 EAAT5,而 EAAC1可以通过神经系统广泛表达于神经元及非神经组织中[21],EAAC1转运谷氨酸的速度约是转运载体 GLAST和 GLT-1转运速度的 10倍,是 XAG-系统中最重要的谷氨酸转运载体。

2.1.2 EAAC1的功能特性

EAAC1首先是一种高亲和力的谷氨酸转运载体,在保持细胞外谷氨酸浓度,防止兴奋过度和兴奋性中毒方面起关键作用[22]。EAAC1与其他兴奋性氨基酸载体不同,它不是神经特异性,可以在一些非神经组织表达,比如前胃、肝脏、肾、胰腺[23]。EAAC1除了具有清除细胞外谷氨酸的作用,还具有转运半胱氨酸的作用[24]。EAAC1对半胱氨酸和谷氨酸转运的一个重要区别在于它能更有效地远距离转运半胱氨酸[14]。

Kiyama等[25]观察到在小鼠的运动神经元损伤后 EAAC1表达下降,而这种现象未在大鼠中发现。EAAC1表达受到抑制和运动神经元死亡有关,这种现象引发关于 EAAC1潜在的神经保护机制的研究。EAAC1这种独特的抗凋亡机制可以在抢救运动神经元损伤过程中发挥作用,这表明EAAC1在预防神经元损伤方面具有多重调节机制。

2.1.3 EAAC1的调节机制

EAAC1的表达活动受细胞内蛋白激酶Cα亚型(PKCα)和磷脂酰肌醇 -3-激酶(PI3K)参与的信号通路的高度调节,这些调节过程在翻译水平或转录后水平都可以发生[26]。

血清和糖皮质激素调节蛋白激酶 1(SGK 1)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1(PDK 1)可以正调控 EAAC1的表达[27],而 δ-阿片受体 (DOR)、谷氨酸转运联合蛋白 3-18(GTRAP3-18)和磷脂酰肌醇三羟基激酶抑制剂渥曼青霉素可以负调控EAAC 1的表达[19]。其中 GTRAP3-18是一种含有188个氨基酸,相对分子质量为 22 500的蛋白质[28]。GTRAP3-18可以直接和 EAAC1主链的C-末端相连从而负调控 EAAC1对谷氨酸的转运[19,29]。GTRAP3-18位于内质网内,可以通过限制 EAAC1从内质网流出来阻止 EAAC 1成熟[30]。

EAAC1表达的另外一种调节机制是使羧基端磷酸化。465位的丝氨酸残基被认为是重要的磷酸化位点,可以控制 EAAC1在细胞内的空间分布[31]。

血小板源性生长因子(PDGF)可以通过激活蛋白激酶 B(Akt)和 PI3K所组成的信号通路来途径提高 EAAC1的表达[32],如图 2所示。激活蛋白激酶 C(PKC),尤其是 PKCα,可以提高细胞膜表面 EAAC1的表达和启动对谷氨酸的转运活动。然而,PKCα可以不通过改变细胞膜的构象增强EAAC1的表达[33]。12-十四酸佛波酯 -13-乙酸盐(PMA)是 PKC的激活因子,可以提高细胞膜表面 EAAC1的表达和活性[34]。

2.2 XC-转运系统

2.2.1 XC

-转运系统分类及特点XC

-系统是谷氨酸/胱氨酸转运载体,1980年,在培养的人体二倍体成纤维细胞中首次被发现[35]。XC

-系统由 2种亚基载体成分组成：表面抗原重链 4F2hc(也称为 CD98)和特异性的轻链载体 xCT。在 XC-系统作用下,细胞释放 1分子的谷氨酸,并摄取 1分子胱氨酸入胞,两者形成偶联转运。胱氨酸的转运包括 2部分,一部分在胞内迅速被还原成半胱氨酸,参与胞内重要自由基清除剂谷胱甘肽的合成;另一部分则被转运出细胞外,氧化成胱氨酸,重新参与 XC-系统循环,因而形成了 1个胱氨酸、半胱氨酸氧化还原循环回路。XC-系统转运功能依赖于谷氨酸及胱氨酸跨膜浓度差高低,是非 Na+依赖转运系统。

图 2 EAAC 1的调节机制Fig.2 Regulatorym echanisms of EAAC 1[4]

从结构上来说,XC-转运系统属于异侧的氨基酸转运载体(HAT)家族中的一员。这些转运载体是由一条重链(HSHAT)和一条轻链(LSHAT)通过二硫键偶联在一起形成的。重链参与异二聚体向细胞膜的运输,而轻链则负责转运和底物特异性。对于XC-转运系统的重链 4F2hc仅有 1个跨膜区,被推测可能不具备转运活性。因此,xCT才是XC-转运系统中起关键作用的亚单位,负责特异性转运胱氨酸和谷氨酸。

2.2.2 xCT的转运功能

xCT转运载体有 2个主要功能：一方面它介导细胞内外谷氨酸/胱氨酸转运,通过交换摄取胱氨酸进入细胞内,以满足细胞内谷胱甘肽合成的需要。这对保持细胞内谷胱甘肽的水平尤为重要,因为谷胱甘肽是保护细胞免受氧化应激和其他化学物质损伤所必需的。另一方面,它可以维持细胞胱氨酸和半胱氨酸的氧化还原平衡。在细胞外的环境中,半胱氨酸迅速被氧化成胱氨酸,因此胱氨酸在循环中尤其在培养基中是主要的氨基酸形式,而在细胞内则以半胱氨酸为主[16]。

2.2.3 xCT的转运机制

在体内,向细胞内转运的胱氨酸与向细胞外转运的谷氨酸按照浓度梯度呈 1∶1的交换(图 3)。细胞内的胱氨酸很快削减至半胱氨酸,而细胞外的氧化条件则有助于胱氨酸的形成。有报道表明,胱氨酸与谷氨酸交换运输时依赖 Cl-的存在,不过其可能是在低浓度的胱氨酸(＜10μmol),而不是高浓度(＞1 mmol)时发生;细胞内如果谷氨酸不足,可以导致 XC-系统活性降低,减少胱氨酸转运[10]。

图3 XC-介导的谷氨酸/胱氨酸转运Fig.3 G lutamate/cystine system transported by X-[10]C

在成纤维细胞中,谷胱甘肽的清除会诱导XC-过程,导致非 Na+依赖谷氨酸转运的增加,因此增加了细胞内谷胱甘肽的合成。另外,有研究发现氧化应激在某些细胞培养中对 XC-有正向调控功能,即 XC-介导的谷氨酸转运可由氧化应激引起[8]。XC-过程的正调控会使细胞外聚集更多的谷氨酸,这样潜在引起了胞外细胞毒性增加的可能[10],同时抑制胞内胱氨酸的含量,导致胞内谷胱甘肽水平的下降。

2.3 ASC转运系统

2.3.1 ASC转运系统分类及特点

Na+依赖性氨基酸转运系统 ASC是经典的中性氨基酸转运系统[17,36],对谷氨酰胺和天冬酰胺等小分子氨基酸具有很高的亲和力。ASC转运载体系统包括 ASCT1和 ASCT2,已经在人类和小鼠中鉴定出来[36]。与谷氨酸转运载体需要 K+来使其构象改变相比,ASC转运载体不需要和 K+偶联[17]。同样,ASC转运载体与 H+的转运也是非偶联的[37]。

2.3.2 ASCT2的功能特性

ASCT2可以以很高的亲和力转运谷氨酰胺,为谷氨酸提供前体物,并维持细胞内谷氨酸的动态平衡[6,37],而 ASCT1没有此功能。ASCT2可以在肺、骨骼肌、大肠、肾、睾丸以及脂肪组织等表达,在肾和肠道,ASCT2分别位于近端小管细胞和肠上皮细胞刷状缘表面[38]。尽管谷氨酸转运载体和 ASC在转运的底物上有明显的区别,但底物识别方面的共同特性反映出它们结构的相似性。比如谷氨酸转运载体,尤其是 EAAC1,可以转运中性氨基酸半胱氨酸。反之亦然。尽管 ASCT2与谷氨酸的亲和力很低,但 ASCT2仍然可以转运谷氨酸[36-37],低 pH可以增强 ASCT2对谷氨酸的转运。

2.3.3 ASCT2的转运机制

疏水性分析显示,ASCT2可能存在 10个跨膜区域[37],在跨膜区 3、4之间的细胞外区域可能存在 2个 N-糖基化位点,细胞内区域可能存在 2个蛋白激酶 C依赖性的磷酸化位点。目前已知,氨基酸的跨膜转运是由肠上皮细胞刷状缘的膜转运系统来完成的。通过这些膜转运系统,氨基酸底物才能够从细胞膜的一侧转运至另一侧,从而执行其广泛而又复杂的生理功能。研究已经证实,小肠上皮细胞刷状缘表达 ASCT2是一种广谱的中性氨基酸载体,主要吸收谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸等中性氨基酸,为细胞代谢提供重要的营养底物。与 Na+非依赖性氨基酸转运系统相比,Na+依赖性氨基酸转运系统由于可利用细胞膜两侧 Na+电势梯度和逆浓度梯度转运氨基酸,在肠腔内对氨基酸的吸收起着中心作用[38]。

3 小 结

维持细胞中谷胱甘肽含量是谷氨酸转运的动力,而由于半胱氨酸为谷胱甘肽合成中谷氨酸循环限速酶的底物,谷氨酸转运又受到半胱氨酸的限制。

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