不同类型栽培半夏同工酶分析

韩 凤，韦 波，封孝兰，全 健，曹厚强，梁正杰

（重庆市药物种植研究所，重庆 408435）

半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit]是我国重要的传统中药材，也是重要的出口产品。具燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效，主治痰多咳嗽、呕吐反胃、胸脘痞气等症。广泛分布于我国长江流域以及东北、华北等地区[1]。生长于不同环境或同一生态环境的不同居群，甚至同一居群的不同个体间，半夏的各种器官(包括根、球茎、珠芽、叶片、叶柄等)在形态上都存在着丰富的变异类型，其中以叶、球茎和珠芽的变异更明显[2-5]，具体表现为种内居群间出现不同程度的分化现象，这必将影响到药材质量的稳定。生产上推广种植的半夏均是一个复杂的混合群体，因此选育高产、优质和多抗的半夏新品系已成为育种工作者的当务之急。为此，本研究以同一生长期的栽培半夏叶片为材料，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其过氧化物同工酶（POD）、酯酶同工酶（EST）的检测和分析，从分子水平探讨栽培半夏的种内分化情况，为半夏的资源收集和优良品系的选育提供更多的遗传背景资料。

1 材料和方法

1.1 供试材料及设备

于5月上旬重庆市药物种植研究所标本园采摘栽培的半夏。根据叶片的形状分为竹叶叶型（Ⅰ）、椭圆叶型（Ⅱ）、芍药叶型（Ⅲ）、心叶型（Ⅳ）。电泳设备为DYCZ-28A型电泳槽及DYY-12型电脑三恒多用电泳仪。

1.2 试验方法

1.2.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 按胡能书等[6]的方法制备聚丙烯酰胺凝胶，每板12个点样槽。分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度3%。

1.2.2 酶液的制备 将半夏的叶片用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干水分后，各称取2 g加Tris-HCl（pH值8.2）提取缓冲液5mL，冰浴中充分研磨成匀浆，低温下3 500 r/min离心20 min，上清液为酶的粗提取液，加少量40%蔗糖混合均匀，置冰箱中冷藏备用。

1.2.3 电 泳 用50μL微量进样器吸取酶液点在样品槽中，加入2滴溴酚蓝指示电泳前沿。在4℃冰箱中恒压电泳，起始电压为112 V，待示踪指示剂进入分离胶后增大到210 V，待溴酚蓝移至距胶前沿1 cm处停止电泳，电泳全过程为4 h。

1.2.4 染 色 过氧化物酶同工酶用醋酸-联苯胺法染色；酯酶用乙酸-α-萘酯、乙酸-β-萘酯及固蓝B盐染色，待酶带清晰用蒸馏水漂洗后，置7.5%冰醋酸中固定。选取酶带清晰重复性好的胶版摄影，根据酶谱中酶带的迁移率大小和酶带的强弱绘制酶谱模式图。

2 结果与分析

2.1 过氧化物酶（POD）同工酶

4个不同叶型半夏过氧化物酶（POD）同工酶电泳模式图见图1。由图可见，供试的半夏过氧化物酶同工酶酶谱差异显著，其具体表现为迁移率、酶带数和酶带强弱显著不同，呈现出丰富的多态性。图上共显示出13条酶带，酶带的Rf值在0.032～0.836之间，其中有1条谱带为所有供试材料共有，即Rf值为0.688的谱带。由于迁移率的差异，整个酶谱从负极到正极可划分为2个区域，即慢带区（A区）和快区（B区），A区＜0.2，B区＞0.5。A区有6条酶带，其中有2条为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种类型所共有，Ⅰ类型比Ⅱ、Ⅲ类型多Rf=0.106这一条。Ⅳ类型有3条酶带Rf分别为0.032、0.053、0.089，都不同于其他3种类型。

图1 4个类型半夏过氧化物酶（POD）同工酶电泳模式图

2.2 酯酶（EST）同工酶

4个不同叶型半夏酯酶（EST）同工酶电泳模式图见图2。供试材料共显示出9条谱带，Rf值在0.032 6～0.717 4之间，其中有3条谱带是共有谱带，即 Rf分别为 0.032 6、0.076 0、0.673 9，说明它们都有较为相似的遗传背景。Ⅲ、Ⅳ类型谱带最少，只有4条；Ⅱ类型有5条谱带；Ⅰ类型最多，有7条。而Ⅱ、Ⅲ类型分离酶带有4条完全一致，除Ⅱ类型比Ⅲ类型多1条外，酶带颜色深浅和迁移率均一致，说明这两种类型具有共同起源的基因表现，而不同的谱带说明各自在特定的生长环境或不同进化过程中已经发生了趋异分化，可将二者归为一类型加以选育。试验结果表明，所取4种不同叶型半夏的样品，经多次重复测试分析，其总趋势是一致的，可划分为3组，即Ⅰ为一类型，Ⅱ、Ⅲ为同一类型，Ⅳ为一类型。

图2 4个类型酯酶（EST）同工酶电泳模式图

3 结论与讨论

（1）细胞学研究结果已证明半夏是一个复合多倍体，个体间的差异从本试验的2种同工酶酶谱分析结果也得到了证实。共有的特征性谱带可认为是相互之间具有共同起源的基因表现，而不同的谱带说明各自在特定的生长环境或不同的进化过程中已发生了趋异分化。

（2）过氧化物、酯酶同工酶电泳数据分析表明半夏不同类型之间既有共同酶带，又有各自的特征酶带，酶谱反映了半夏不同类型之间的相互联系与区别。试验证明在同一栽培条件下，不同个体叶片的过氧化物酶、酯酶同工酶，除少数特征谱带外，多数谱带的出现频率有较大差异，指标在半夏不同类型之间具有特异性，且与半夏在形态学上的差异性是一致的，可用作分类鉴定依据之一。

（3）半夏不同类型之间谱带的差异表现在特征酶带颜色深浅不同，宽度不同，迁移率也不同，这一方面说明了这些材料间存在着共同的遗传基础，或者说，它们之间有不同程度的亲缘关系；另一方面也反映了各材料间存在着不同程度的遗传差异。

[1] 中国医学科学院药物研究所.中药志（第2册第2版）[M].北京：人民卫生出版社.1993.

[2] 陈 宏.半夏研究进展[J].现代农业科技，2010，（5）：80-81.

[3] 裴建文，孙新荣，王 鹏，等.施肥对半夏总蛋白质含量的影响[J].广东农业科学，2010，（2）：79-83.

[4] 程霞英，陶晓晔.三叶半夏组织培养研究 [J].安徽农业科学，2010，（3）：1643-1645.

[5] 郭巧生，沈文飚，刘 丽，等.半夏种内不同居群酯酶和超氧化物歧化酶同工酶酶谱特征分析 [J].植物资源与环境学报，2001，10（2）：42-46.

[6] 胡能书，万贤国.同工酶技术及其应用[M].长沙：湖南科技出版社，1985.74-75.