小鼠Aire逆转录病毒表达载体的构建及表达

李 娟，张 君，张 毓

（1.天津医科大学免疫学教研室，天津300070；2.北京大学医学部免疫学系，北京100191）

Aire（autoimmune regulator）是一种自身免疫调节因子，其基因发现于1997年，由于Aire基因突变导致自身免疫性多内分泌病变-念珠菌病-外胚层营养不良（autoimmune polyendocri-nopathy candidiasis and ectodermal dystrophy，APECED），近几年引起人们的广泛关注。Aire基因主要表达于胸腺、淋巴结和脾脏，研究表明Aire通过诱导外周组织抗原（PTAs）在胸腺髓质上皮细胞中的表达促进自身反应性胸腺细胞的克隆清除，从而建立中枢耐受[1]。我们发现RelB缺陷小鼠和Aire缺陷小鼠中均存在CD4单阳性（single positive，SP）胸腺细胞发育缺陷[2]，并且有研究表明RelB缺陷小鼠中Aire的表达显著减少[3]，这些结果均提示Aire对SP胸腺细胞的最终成熟可能发挥重要作用。MigR1质粒是一种逆转录病毒载体，该载体多克隆位点MCS后加入内部核糖体进入位点IRES和绿色荧光蛋白GFP序列；逆转录病毒感染宿主细胞的范围较为广泛，且外源目的基因易整合入宿主细胞基因组，表达长期稳定[4]。本研究拟在MigR1的多克隆位点处插入小鼠Aire基因的ORF序列，构建能够稳定表达Aire蛋白的重组质粒，收集逆转录病毒上清，感染胸腺基质细胞系，为进一步研究Aire的生物学功能作准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 293T细胞，MTEC9(小鼠胸腺基质细胞系，由北京大学医学部免疫学系T细胞研究室建立)。

1.1.2 质粒与菌株 MigR1逆转录病毒载体质粒、pHIT123质粒（编码鼠白血病病毒包膜蛋白）、pCGP质粒（编码鼠白血病病毒gag/pol）由陈友海教授（U－ niversity of Philadelphia,USA）赠予；DH-5α感受态细菌由本室保存。

1.1.3 主要试剂 TRIzol®试剂购自Gibco BRL公司；Taq DNA聚合酶购自天为时代生物技术有限责任公司；BglII、XhoI等限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶、逆转录试剂盒、Wizard Plus质粒提取试剂盒、CIAP（Calf Intestinal Alkaline Phosphatase）、NBT/ BCIP底物均购自Promega公司；质粒大量提取纯化试剂盒购自北京威格拉斯生物技术有限公司；Jet－PEITM转染试剂盒购自Polyplus公司；凝胶回收试剂盒（QIAEX II Gel Extraction System）购自Qiagen公司；anti-FLAG mAb、AP（碱性磷酸酶）-anti-rabbit-IgG购自Promega公司；anti-Aire多克隆抗体购自Upstate公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Aire ORF扩增 利用Gene Runner软件分析Aire的核苷酸序列，在ORF两侧设计两条引物:上游引物：5’-GGG ATG GAA TGC TAC GCC-3’；下游引物：5’-TCA GGA AGA GAA GGG TGG TG-3’。以新鲜分离的小鼠胸腺基质细胞的cDNA为模板，Taq DNA聚合酶-Pfu DNA聚合酶联合使用进行PCR扩增，扩增aire全长ORF（94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃90s，72℃7min，共35个循环）。1.0%琼脂糖凝胶电泳确定目的片段。

1.2.2 Aire基因的克隆 利用QIAEX II Gel Extraction Kit凝胶回收并纯化目的片段，取纯化后产物5.0μL，加入10×PCR buffer1.0μL，dNTP 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌水3.0μL，混匀后72℃20min。取加A尾后的产物3.0μL加入2× rapid ligation buffer 5.0μL，pGEM-Teasy1.0μL和T4DNA ligase1.0μL，4℃连接过夜。用连接产物转化DH-5α感受态细菌，经蓝白斑筛选，挑取8～10个白色单克隆细菌，LA液体培养基振摇培养过夜，PCR鉴定（用克隆Aire ORF全长的引物），选取表达Aire的阳性克隆细菌，测序(北京三博远志生物技术有限公司)。将测序正确的阳性克隆菌液提取质粒备用。

1.2.3 Aire逆转录病毒表达质粒的构建及鉴定

1.2.3.1 BglII酶切位点的加入：在上下游引物的5’端分别合成BglII酶切位点，并在下游引物中加入FLAG标签，便于构建表达后的检测。

以1.2.2中提取的质粒为模板，使用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，94℃5min，94℃30s，60℃45s，72℃90s，72℃7min，共35个循环。PCR产物胶回收、纯化、测序如前面所述。

1.2.3.2 MigR1质粒的单酶切以及去磷酸化：用BglII单酶切MigR1质粒(37℃，3～4h)，凝胶回收酶切后的MigR1片段。取酶切后MigR115.0μL，加入10×buffer 5.0μL，0.01U/μL CIAP 5.0μL，无菌水25.0μL，37℃反应30min，在反应体系中再加入5μL 0.01U/μL CIAP，37℃，30min。使用QIAEX II Gel Extraction Kit将去磷酸化的产物立即进行脱盐和浓缩。

1.2.3.3 T-easy-Aire重组质粒的单酶切：用BglII单酶切T-easy-Aire重组质粒（37℃，3～4h），电泳，胶回收。

1.2.3.4 MigR1-Aire重组质粒的构建及鉴定：将酶切后T-easy-Aire 7.0μL和去磷酸化后MigR11.0μL混合，加入10×ligation buffer 1.0μL和T4DNA ligase1.0μL，4℃连接过夜。用连接产物转化DH-5α感受态细菌，经蓝白斑筛选，挑取10个白色单克隆细菌，LA液体培养基振摇培养过夜，提质粒，用BglII和XhoI进行酶切鉴定（BglII鉴定是否连接成功，XhoI鉴定连接方向是否正确），保存正向连接的菌种和质粒。选择正向连接的质粒，使用JetPEITM转染试剂盒转染293T细胞，转染48h后荧光显微镜观察转染效率。裂解细胞，Western blot检测Aire蛋白的表达。

1.2.4 逆转录病毒上清的收集 在10cm培养皿中接种包装细胞293T，细胞汇合度约20%，24h后将培养基替换为37℃预温的无血清DMEM，每孔10mL，在孵箱中放置10～30min；配制如下反应混合液：逆转录病毒质粒DNA 10μg，pHIT123质粒10μg，pCGP质粒10μg，2.5mol/L CaCl250μL，加无菌水补至500μL；将此混合液缓慢旋转加入500μL 2×HBS中，吹泡混匀，室温孵育30min；轻轻滴加至6孔板中，轻摇培养板混匀，37℃静置；5h后将培养孔中的液体换为37℃预温的DMEM-10%NCS，5～6mL/孔。48h后，收集上清，用0.45μm的滤器过滤或者1500r/min离心5min，获得的上清中含有短暂产生的病毒，将病毒上清分装，-70℃储存。

1.2.5 逆转录病毒上清体外感染胸腺基质细胞系

提前12～24h在6孔板中接种胸腺基质细胞系(大约2×105/孔)；配制DMEM-10%NCS与polybrene (终浓度4μg/mL)的混合液；将6孔板中的培养基移去，在各孔中分别加入上述混合液与病毒上清（总体积2mL，可加入不同比例体积的逆转录病毒上清，但其体积应小于或等于感染混合液终体积的1/2），2500r/min离心90min；37℃孵育24h后将孔中液体更换为DMEM-10%NCS；48h后，用0.05%EDTA消化细胞，重悬在BSS-2%NCS中，制成单细胞悬液，FACS无菌分选GFP+细胞。裂解细胞，用anti-Aire polyclonal antibody进行Western blot检测。

2 结果

2.1 Aire ORF片段的获取 小鼠Aire基因全长1936bp，Gene Runner分析其ORF为58-1716，编码产物约60kDa。通过PCR扩增，得到约1.65kb的扩增片段（图1）。

图1 Aire ORF的扩增Fig 1 Amplification of Aire ORF

利用Gene Runner软件分析Aire基因的限制性酶切位点，未能找到适合的限制性酶切位点以便构建逆转录病毒表达质粒，因此我们设计了含BglII酶切位点的引物，并在下游引物中加入FLAG标签，便于构建表达后的检测。以Aire ORF为模板进行PCR扩增，得到含BglII酶切位点以及FLAG标签的Aire片段（Aire-BglII）（图2）。

图2 含BglII酶切位点及FLAG标签的Aire的扩增Fig 2 Amplification of Aire with BglII restriction enzyme cutting site and FLAG tag

2.2 Aire逆转录病毒表达载体的构建 经BglII酶切鉴定连接成功。用Gene Runner软件分析Aire序列的限制性位点，发现在473位有XhoI位点，若为正向连接，XhoI酶切后的小片段应在1243bp左右，若为反向连接，XhoI酶切后的小片段应在416bp左右。结果显示挑取的9个阳性克隆均连接成功，但是只有5个为正向连接（图3）。

选取正向连接的重组质粒转染293T细胞，转染48h后荧光显微镜观察转染效率约45%～50%（图4）。

利用anti-FLAG mAb进行Western blot检测，结果显示在60kDa左右有条带（图5），证明构建的逆转录病毒表达质粒能够成功表达Aire蛋白。

图3 MigR1-Aire酶切鉴定Fig 3 Verification of recombinant MigR1-Aire by restriction enzyme digestion

图4 转染后293T细胞的GFP表达Fig 4 The expression of GFP of 293T cells after transfection

图5 Western blot鉴定Aire蛋白的表达Fig 5 Western blot analysis of Aire protein

构建的MigR1-Aire示意图见图6。

图6 构建的MigR1-Aire示意图Fig 6 Sketch map of the recombinant plasmid MigR1-Aire

2.3 Aire蛋白在MTEC9细胞内强制性表达 用质粒MigR1-Aire及MigR1转染包装细胞系293T细胞，收集病毒上清感染MTEC9，流式细胞仪检测GFP的表达，感染效率约30%～35%（图7）。

图7 逆转录病毒上清感染MTEC9的效率检测Fig 7 The efficiency of infection with retroviral supernatant in MTEC9

MTEC9-Aire的裂解产物经抗体杂交后在60kDa左右出现条带，而MTEC9-MOCK则没有，表明Aire蛋白在MTEC9细胞内表达成功（图8）。

图8 Aire在MTEC9中的表达检测Fig 8 WesternblotanalysisofAireproteininMTEC9afterinfection

3 讨论

胸腺内T淋巴细胞的发育受到复杂而精细的调控，目前对于调控DN/DP/SP这几个阶段的转换及其中一些重要事件（如阳性选择、阴性选择等）的分子机制已有很多报道，但是关于SP胸腺细胞在髓质区分化过程的分子调控机制仍缺乏详细阐述。

我们对RelB缺陷小鼠和Aire缺陷小鼠的研究提示Aire在CD4SP胸腺细胞的最终成熟阶段可能发挥关键作用[2]。近几年的研究发现，Aire除了能够通过诱导PTAs的表达诱导中枢免疫耐受，还能通过参与调节胸腺髓质上皮细胞（medullary thymic epithelial cells,mTECs）的分化及功能的其它多方面来诱导中枢免疫耐受，如调节某些参与抗原提呈及处理的分子[5-6]，调节mTECs的分化[7-8]，调节mTECs中趋化因子CCR4和CCR7配体的表达[9]等。Aire究竟通过何种机制影响胸腺细胞的终末分化？要阐明此机制，构建能够融合表达GFP和Aire蛋白的表达质粒是非常有必要的。

我们可以分离Aire缺陷小鼠的mTECs，将其与正常小鼠来源的SP1细胞共育，检测其能否支持SP3向SP4的转化；若不能支持，我们将使用本研究中构建的Aire逆转录病毒表达载体，在Aire缺陷小鼠的mTECs中强制性表达Aire，观察能否纠正此缺陷。我们曾试图找到表达Aire的胸腺基质细胞系，但是在多株小鼠胸腺基质细胞系中并没有找到表达Aire的细胞系。本研究利用收集的逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞系MTEC9，在该细胞系中成功表达Aire，为进一步研究Aire的强制性表达对胸腺基质细胞诱导SP胸腺细胞分化功能的影响奠定了基础。

［1］ Anderson MS,Venanzi ES,Klein L,et al.Projection of an immunol ogical self shadow within the thymus by the Aire protein[J].Science, 2002,298(5597):1395

［2］ Li J,Li Y,Yao JY,et al.Developmental pathway of CD4+CD8-medullary thymocytes during mouse ontogeny and its defect in Aire-/-mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(46):18175

［3］ Zuklys S,Balciunaite G,Agarwal A,et al.Normal thymic architecture and negative selection are associated with Aire expression,the gene defective in the autoimmune-polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy(APECED)[J].J Immunol,2000,165(4): 1976

［4］ Pear WS,Miller JP,Xu L,et al.Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in micereceivingP210bcr/abl-transducedbonemarrow[J].Blood,1998, 92(10):3780

［5］ Anderson MS,Venanzi ES,Chen Z,et al.The cellular mechanism of Aire control of T cell tolerance[J].Immunity,2005,23(2):227

［6］ Gray D,Abramson J,Benoist C,et al.Proliferative arrest and rapid turnover of thymic epithelial cells expressing Aire[J].J Exp Med, 2007,204(11):2521

［7］ Gillard GO,Dooley J,Erickson M,et al.Aire-dependent alterations in medullary thymic epithelium indicate a role for Aire in thymic epithelial differentiation[J].J Immunol,2007,178(5):3007

［8］ Dooley J,Erickson M,Andrew GF.Alterations of the medullary epithelial compartment in the Aire-deficient thymus:Implications for programs of thymic epithelial differentiation[J].J Immunol,2008, 181(8):5225

［9］ Laan M,Kisand K,Kont V,et al.Autoimmune regulator deficiency results in decreased expression of CCR4and CCR7ligands and in delayed migration of CD4+thymocytes[J].J Immunol,2009,183(12):7682