替米沙坦对OLETF大鼠自发性2型糖尿病的干预作用

郑喜兰，田凤石，雒 瑢，赵紫琴，姚瑞栋

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市公安医院内科，天津 300050）

单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）属于趋化因子超家族C-C亚族，主要由内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等多种细胞产生，是介导巨噬细胞激活和趋化的重要介质，可诱导巨噬细胞由外周血液循环进入脂肪组织使其激活、分泌多种炎性因子如IL-6、TNF-α等。脂肪组织的慢性炎症在肥胖相关的胰岛素抵抗（IR）中发挥着重要作用[1]，而IR又是2型糖尿病（T2DM）发病的关键因素。本实验旨在研究替米沙坦对早期高脂喂养OLETF大鼠睾周脂肪组织MCP-1mRNA表达的影响，进一步探讨替米沙坦在减轻IR、预防糖尿病方面的作用。

1 材料与方法

1.1 饲养及分组 4周龄雄性 OLETF（Otsuka long-evans tokushima fatty） 大鼠 30只和 LETO（Long-evans tokushima otsuka）大鼠12只均以标准饲料适应喂养4周。自由获取水和食物。8周龄OLETF大鼠饲高脂饲料，LETO大鼠饲标准饲料。22周龄根据口服葡萄糖耐量实验（OGTT）2h血糖和体重将未发生糖尿病的30只OLETF大鼠随机分为3组，每组10只：（1）替米沙坦组（T）：高脂饮食加替米沙坦。（2）二甲双胍组（M）：高脂饮食加二甲双胍。（3）高脂对照组（O）：高脂饮食。LETO大鼠12只，为对照组（NC）。每日灌胃1次，T组替米沙坦5mg/kg，M组二甲双胍100mg/kg，其余两组等量蒸馏水灌胃。48周龄股动脉放血处死大鼠，取血5mL，分离血清，取睾周脂肪组织。

1.2 实时荧光定量PCR检测MCP-1mRNA表达水平 提取睾周脂肪组织总RNA（2μg），逆转录为cDNA。MCP-1上游引物Pf,mcp-1：5′-AAC CAG CCA ACT CTC ACT GAA GCC A-3′，MCP-1下游引物Pr,mcp-1：5′-GAT TCT CTT GTA GTT CTC CAG CCG A-3′，GAPDH上游引物Pf,GAPDH：5′-TCG TGG AGT CTA CTG GCG TCT T-3′，GAPDH下游引物Pr,GAPDH：5′-CAG TCT TCT GAG TGG CAG TGA T-3′。反应体系：25μL体系中加入SYBR Green Master Mix 12.5μL，Pf,mcp-1（10μmol/L）和Pr,mcp-1（10μmol/L）各2μL，cDNA 2.5μL，ddH2O6μL。反应条件（Bio-Rad公司Chromo 4）：95℃预变性60s，95℃变性15s，59.4℃（MCP-1）或58.8℃（GAPDH）退火60s，共39个循环。采用相对定量方法，根据实时荧光定量PCR反应所获得的CT值来决定基因表达水平，基因表达量以2-△△CT的值进行统计，△CT1表示每只大鼠睾周脂肪组织目的基因（MCP-1）和内参基因（GAPDH）CT值的差值，即CT,MCP-1-CT，GAPDH，△CT2表示O组目的基因（MCP-1）和内参基因（GAPDH）CT值差异的均值，即CT，MCP-1（o）-CT,GAPDH(o)，△△CT即△CT1-△CT2。

1.3 血清指标检测 血清MCP-1、游离脂肪酸（FFA）采用ELISA法，空腹血糖（FBG）采用葡萄糖氧化酶法，胰岛素（FINS）采用放射免疫法测定。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=（FINS×FBG）/22.5。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，计量资料经正态性检验，以±s表示。多组间资料比较采用单因素方差分析（ANOVA）检验，两两比较使用LSD法。

2 结果

2.1 各组间睾周脂肪组织MCP-1mRNA表达水平的比较 MCP-1mRNA表达量NC组为0.21±0.08，O组为1±0.3，M组为0.17±0.19，T组为0.20±0.12，F=6.044，P<0.01。见图1。

图1 大鼠睾周脂肪组织MCP-1mRNA的表达Fig 1 The expression of MCP-1mRNA in adipose tissue

2.2 各组间血清 MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR比较 T组和M组MCP-1均低于O组（P<0.05）。T组FFA低于O组和M组（P<0.01），且T组FBG及HOMA-IR均低于O组（P<0.05）。T组的FINS低于M组（P<0.05）。见表1。

表1 大鼠各组间血清MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR比较(±s)Tab 1 Comparison of MCP-1,FFA,FBG,FINS and HOMA-IR among groups of rats(±s)

表1 大鼠各组间血清MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR比较(±s)Tab 1 Comparison of MCP-1,FFA,FBG,FINS and HOMA-IR among groups of rats(±s)

与NC组比较★P<0.05，★★P<0.01；与O组比较●P<0.05，●●P<0.01；与M组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01

组别NC O M T例数12101010MCP-1(pg/mL) 33.85±8.9243.90±6.73★★34.74±6.35●34.64±7.60●FFA(mmol/L) 2.53±1.595.31±1.84★★6.33±2.72★★2.85±0.68●●▲▲FBG(mmol/L) 5.83±0.6815.40±7.11★★14.67±6.77★★9.98±5.85●FINS(UIU/mL) 15.30±4.0825.96±9.49★32.61±15.59★20.88±10.58▲HOMA-IR 4.04±1.4317.75±10.09★★19.49±8.13★★10.04±8.58●▲T2DM发病率（%）08010040

3 讨论

OLETF大鼠是一种比较公认的自发性T2DM动物模型，其胆囊收缩素（CCK）受体1缺陷[2]，导致了该大鼠多食、肥胖。有研究表明高脂饮食可诱导IR的发生，从而诱发糖尿病[3]。为此本研究采用高脂喂养OLETF大鼠，在48周龄时检测发现O组睾周脂肪组织MCP-1mRNA的表达明显增加，血清MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR也明显高于NC组，同时80%大鼠发生糖尿病。Kazuhiko等[4]在研究中也发现饮食诱导的肥胖大鼠脂肪组织中MCP-1mRNA的表达是正常大鼠的7.2倍，血浆中的MCP-l水平也明显升高。肥胖小鼠白色脂肪组织是MCP-1的主要来源[5]，且MCP-1与IR密切相关，它可以降低胰岛素刺激的脂肪细胞糖的摄取，并影响脂肪细胞的内分泌功能，且通过激活核因子-κB（NF-κB）促进炎症反应的发生、发展。

有实验表明对高脂喂养的C57BL/6小鼠给予10mg/(kg·d)缬沙坦可以提高其糖耐量水平，并直接降低小鼠脂肪组织巨噬细胞的浸润和MCP-1的表达[6]。本研究发现经替米沙坦干预后的高脂喂养的OLETF大鼠睾周脂肪组织MCP-1mRNA表达明显下降，同时血清MCP-1、FFA及FBG水平也显著降低，大鼠的IR得到改善，其糖尿病的发病率也有所下降，而二甲双胍虽能降低OLETF大鼠睾周脂肪组织MCP-1mRNA表达及血清MCP-1水平，但对FFA、FBG、FINS、HOMA-IR及糖尿病的发生率均无影响。表明替米沙坦可能通过减少MCP-1的表达而改善IR，达到预防糖尿病的作用。其可能机制为：脂肪组织具有完整的肾素血管紧张素系统，可以产生血管紧张素Ⅱ，后者通过激活NF-κB诱导脂肪组织MCP-1的表达[7]，而替米沙坦是一种长效血管紧张素Ⅱ受体阻断剂，通过阻断血管紧张素Ⅱ的作用而减少脂肪组织MCP-1的表达，同时替米沙坦还有激活过氧化物酶体增殖物激活受体1（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）的作用[8]，而PPARγ的激活可以增加胰岛素的敏感性，二者共同作用可以减轻IR，最终达到早期预防糖尿病的效果。

以往替米沙坦作为降压药物而应用于临床，而本研究发现替米沙坦可通过减少脂肪组织中MCP-1mRNA的表达而起到减轻IR的作用，对早期预防糖尿病有积极的意义。因此，随着对替米沙坦的深入研究，其对糖尿病的早期预防作用有望应用于肥胖且有糖尿病倾向人群的干预，进一步指导临床治疗。

[1] Xu H,Barnes GT,Yang Q,et al.Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance [J].J Clin Invest,2003,112(12):1821

[2] Moran TH,Bi S.Hyperphagia and obesity of OLETF rats lacking CCK1receptors:developmental aspects[J].Dev Psychobiol,2006,48(5):360

[3]Cerf ME.High fat programming of beta-cell failure[J].Adv Exp Med Biol,2010,654:77

[4] Takahashi K,Mizuarai S,Araki H，et a1.Adiposity elevates plasma MCP-1levels leading to the increased CD11b-positive monocytes in mice[J].J Biol Chem,2003,278(47):46654

[5] Sartipy P,Loskutoff DJ.Monocyte chemoattractant protein 1in obesity and insulin resistance[J].PNAS,2003,100(12):7265

[6]Cole BK,Keller SR,Wu R,et al.Valsartan protects pancreatic islets and adipose tissue from the inflammatory and metabolic consequencesofahigh-fatdietinmice[J].Hypertension,2010,55(3):715

[7] Tsuchiva K,Yoshimoto T,Hirono Y,et al.Angiotensin II induces monocyte chemoattractant protein-1expression via a nuclear factor -kappa B-dependent pathway in rat preadipocytes[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2006,291(4):E771

[8] Nakamura T,Kawachi K,Saito Y,et al.Effects of ARB or ACE-inhibitoradministration on plasma levelsofaldosterone and adiponectin in hypertension[J].Int Heart J,2009,50(4):501