Bax、Bcl-2在糖尿病大鼠结肠动力障碍中的作用机制

刘 燕，孙曼怡，冯 凭

（天津医科大学总医院代谢病科，天津300052）

糖尿病结肠动力障碍是糖尿病（diabetes mellitus，DM）病人常见的并发症，严重影响着患者的生活质量，但目前对结肠动力障碍重视不够，其发病机制尚不完全清楚。研究发现，结肠动力障碍可能与微血管病变、胃肠激素分泌异常、自主神经功能障碍、高血糖、平滑肌损害等因素有关，但平滑肌细胞凋亡在结肠动力障碍中的作用机制研究不多。目前研究发现细胞凋亡在DM及其部分并发症的发生中起重要作用[1]。细胞凋亡是由基因控制的细胞有序性死亡。有两类基因调节细胞凋亡：凋亡抑制基因和凋亡促进基因，其中Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是凋亡促进基因。本研究采用实时荧光定量PCR法，检测平滑肌细胞中Bax、Bcl-2的表达，从mRNA水平研究平滑肌凋亡在糖尿病SD大鼠结肠动力障碍发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠25只，体重200～250g（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心）。

1.1.2 主要试剂与仪器 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（联星公司，天津）；活性炭（联星公司，天津）；高纯总RNA快速提取试剂盒（Bioteke公司，北京）；逆转录酶（TaKaRa，大连）；Bax、Bcl-2、β-actin基因引物（宝生物工程有限公司，大连）；SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，大连）；胰岛素试剂盒（九鼎医学生物工程有限公司，天津）；ABI 7500Real Time PCR扩增仪、顺序检测系统（AB公司，美国）；PCR扩增仪（Biometra，德国）；电泳仪（Bio-RAD，美国）；凝胶成像仪（Bio-RAD，美国）；分光光度计（Bio-RAD，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组和糖尿病模型建立 25只大鼠随机分为正常对照组10只和糖尿病组15只。糖尿病组一次性鼠尾静脉注射STZ 40mg/kg，对照组鼠尾静脉注射等量0.1mol/L枸橼酸缓冲液，72h后尾静脉采血，测得血糖≥16.7mmol/L且能维持1周以上者为造模成功。结果有1只未成功，随机选12只作为糖尿病组，两组大鼠均给予普通饲料饲养，不使用胰岛素及降糖药，持续10周，每周鼠尾静脉采血，用拜安捷血糖仪测空腹血糖。

1.2.2 胃肠推进率测定 成模10周末，禁食12h后，两组大鼠给予100g/L活性炭（10ml/kg）灌胃。30min后鼠股静脉取血，放入促凝管中，用于测胰岛素水平。然后复合麻醉剂腹腔注射麻醉，剖腹测量幽门括约肌至肛门的长度及活性炭前端至幽门括约肌的距离。

胃肠推进率=活性炭前端至幽门括约肌的距离/幽门括约肌至肛门的长度×100%

1.2.3 标本收集和处理 取结肠1.0g，DEPC水冲洗后，放入装有0.3mL TRIzol的冻存管中，液氮中保存。另取结肠放入装有10%的中性福尔马林瓶中，石蜡包埋，HE染色观察结肠平滑肌的变化。

1.2.4 高纯总RNA提取与cDNA合成 利用高纯总RNA提取试剂盒，根据说明书提取总RNA。经凝胶电泳后，利用凝胶成像仪观察RNA的完整性，利用分光光度计检测RNA的浓度。逆转录反应体系：模板RNA 2μg，Oligo(dT)Primer（50μmol）4μL，无酶水18μL，70℃保温10min，5×缓冲液8μL，dNTP混合液2μL，Rnase Inhibitor 1μL，Rnase M-MLV 1.2μL，加无酶水，至总量40μL。42℃保温1h，70℃保温15min，反应结束后放入-20℃保存。

1.2.5 引物设计和合成 引物序列如下：Bcl-2：5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′，5′-CGTCTTCAGA GACAGCCAGGAG-3′，预计扩增片段115bp；Bax：5′-aCACCTGAGCTGACCTTGGA-3′，5′-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3′，预计扩增片段133bp；βactin：5′-TCTTGCAGCTCCTCCGTCGC-3′，5′-CTTGCT CTGGGCCTCGTCGC-3′，预计扩增片段229bp。1.2.6荧光实时定量PCR定量检测 反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5μL，引物（10μmol）1μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL，cDNA模板2.0μL，灭菌蒸馏水9.0μL，总体积25μL。扩增标准程序：95℃预变性30s，95℃3s，60℃30s，40个循环。以前12个循环的荧光值作为荧光本底信号，第4～12个循环的标准差的10倍设定阈值，以β-actin为内参，分别得出每个样本的Bax、Bcl-2的CT值，相减后得出ΔCT值即是mRNA的相对表达量。ΔCT值越大，其表达量越少。

1.3 统计学分析 应用SPSS16.0软件进行统计学分析，各组计量资料以均数±标准差（±s）表示。用One-Way ANOVA(单因素方差分析)进行各组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重、空腹血糖、胰岛素水平 成模第10周时，糖尿病模型组体重明显低于正常对照组；其空腹血糖水平显著高于正常对照组；糖尿病组胰岛素水平显著低于正常对照组，两组间比较差异均有统计学意义，见表1。

2.2 胃肠推进率 成模第10周时，糖尿病模型组胃肠推进率低于正常对照组，见表1。

表1 两组体重、空腹血糖、胰岛素水平、胃肠推进率比较Tab 1 Comparison of weight,fasting blood glucose,insulin levels, gastrointestinal propulsion rate between two groups

2.3 结肠平滑肌HE染色结果 对照组结肠平滑肌包括纵行肌和环行肌，肌层厚；糖尿病组平滑肌肌层变薄，肌细胞数目减少，见图1、2。

图1 对照组结肠平滑肌（HE×200）Fig 1 Colonic smooth muscle in the normal group（HE×200）

图2 糖尿病组结肠平滑肌（HE×200）Fig 2 Clonic smooth muscle in the diabetic group（HE×200）

2.4 结肠平滑肌细胞的总RNA抽提结果 提取的总RNA采用分光光度计测浓度，A260/A280值为1.8～2.0，0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪上观察，结果显示28s比18s亮，比例约为2:1，5s几乎看不见，见图3。

2.5 荧光实时定量PCR结果分析 成模第10周时，糖尿病组Bax表达量高于正常对照组（P＜0.05）；糖尿病组Bcl-2表达量低于正常对照组（P＜0.05），差异有统计学意义。见表2。

图3 总RNA电泳结果Fig 3 The electrophoresis results of total RNA

表2 两组Bax和Bcl-2的mRNA表达量比较Tab 2 Comparison of Bax and Bcl-2mRNA express quantity between two groups

溶解曲线图显示，扩增目的基因Bax、Bcl-2、βactin的溶解温度（Tm）值分别为86.6℃、84.8℃、77.1℃，无非特异扩增。

3 讨论

糖尿病是一种以血糖升高为主要表现的慢性疾病，胰岛B细胞的凋亡是其发病的重要机制[2]。国外研究发现50%～60%的糖尿病患者合并有结肠动力障碍，该病主要表现为腹部不适、腹胀、腹泻和便秘等，其病理生理特点为：结肠张力低下，收缩力下降，蠕动减慢，排空延迟。超声检查发现糖尿病病人结肠扩张，动力下降。本实验发现糖尿病大鼠的胃肠推进率比对照组明显减慢，提示结肠蠕动减慢。

1型糖尿病存在着胰岛素绝对缺乏，血糖升高，高糖诱导血管内皮细胞、胰岛细胞、神经细胞、耳蜗细胞等细胞的凋亡。本实验研究发现，糖尿病组胰岛素水平明显低于对照组，HE染色发现糖尿病组结肠平滑肌变薄，肌细胞数目减少，这说明高糖可能诱导平滑肌细胞的凋亡。

林琳等[3]对糖尿病大鼠模型研究发现，胰岛素缺乏，Cajal间质细胞(inte-rstitial cells of Cajal，ICC)的凋亡与结肠动力障碍发病机制有关。ICC是胃肠动力的“起搏”细胞，而平滑肌细胞是胃肠机械活动的基础，平滑肌细胞的凋亡也可能会影响胃肠运动。细胞凋亡受基因调控，Bcl-2蛋白家族被认为是最重要的细胞凋亡调控基因之一，Bcl-2是一种凋亡抑制基因，而Bax是一种促凋亡基因，两者间相互作用调控细胞凋亡[4]。Bcl-2是B淋巴细胞瘤／白血病-2基因的简称,是第一个被发现的凋亡抑制基因，是线粒体上的一种跨膜蛋白[5]。Bcl-2广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种肿瘤细胞，其抗凋亡的机制目前认为主要有：（1）拮抗促凋亡基因Bax；（2）抑制促凋亡的蛋白质细胞色素c自线粒体释放到胞质；（3）阻止胞质中的细胞色素c激活caspase；（4）有抗氧化及维持细胞内钙稳态等作用。Korsmeyer等发现促凋亡基因Bax属于Bcl-2基因家族，与Bcl-2具有高度同源性，编码的Bax蛋白可以与Bcl-2形成二聚体，对Bcl-2有抑制作用，促进细胞凋亡[6]；Bax的表达更为广泛，它可出现在肝细胞、肾小管上皮细胞、呼吸系上皮细胞和支气管平滑肌、血管平滑肌细胞中。近年研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素[7]，当Bax蛋白表达比Bcl-2蛋白明显增多时，所有的Bcl-2蛋白被结合而剩余的Bax蛋白诱导细胞凋亡，反之，Bcl-2多于Bax时，Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡。糖尿病肾病、糖尿病微血管病变及糖尿病神经病变等糖尿病并发症均有Bcl-2凋亡基因家族的参与。在DM合并微血管疾病时Bax及Bcl-2对于内皮细胞凋亡的发生起到重要作用从而加重微血管病变、延迟组织愈合及再生[8]。Jafari Anarkooli等[9]研究证实DM合并海马病变时Bax表达增强、Bcl-2表达减弱导致了海马部位的细胞发生凋亡。

本研究荧光实时定量PCR显示糖尿病组大鼠结肠平滑肌组织Bcl-2的表达低于对照组，Bax的表达高于对照组。这些结果说明随着Bax表达量上升，Bcl-2与Bax形成二聚体后，剩余的Bax诱导平滑肌细胞凋亡。体内、体外实验研究表明，Bcl-2和Bax参与了糖尿病中细胞凋亡的发生。另外，Horvtth等[10]研究发现胰岛素缺乏可造成ICC缺失，以及电起搏受损，是糖尿病胃肠动力障碍发病的关键。Forster等[11]在糖尿病患者的活检中发现胃中ICC数目减少。Takashi等[12]研究发现，平滑肌内皮素受体介导的信号增强，与糖尿病胃病的发病机制有关。但是结肠平滑肌异常与结肠动力障碍之间究竟存在着怎样的病理生理联系、结肠平滑肌细胞的凋亡与ICC之间是否存在联系等问题需要进一步研究阐明。

综上所述，平滑肌细胞的凋亡及Bax、Bcl-2的异常表达可能参与了糖尿病结肠动力障碍的进展过程。

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