Calpain-1在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠心肌中的表达及意义

赵 红，徐 梅，初桂兰

（天津医科大学总医院儿科，天津300052）

缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）大多源于胎儿宫内窘迫及新生儿窒息，是新生儿期危害极大的常见病，也是新生儿死亡的主要原因。近年来研究发现在缺氧、缺血过程中心肌细胞除发生坏死外还发生凋亡，且在缺氧、缺血早期凋亡细胞数量多于坏死细胞[1]。钙蛋白酶1（Calpain-1）与心肌细胞的凋亡关系密切，又由于其在心肌细胞中的特殊分布，从而引起广泛的关注。本研究拟构建新生大鼠HIBD模型，观察Calpain-1在HIBD大鼠心肌中的表达，探讨其在心肌细胞凋亡发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新生7日龄Wistar大鼠64只，健康，雌雄不限，体质量12～18g，由中国医学科学院放射研究所实验动物中心提供。随机分为假手术对照组、HIBD后2、12、24h及2、3、5、7d各组，每组各8只大鼠。各组平均体质量差别无统计学意义（P>0.05）。

1.1.2 主要仪器及试剂 在GenBank中查找到大鼠Calpain-1mRNA（NM-019152.2），Calpain-1、Rat Actin-bate（上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成），Taq酶、dNTP Mixture、Ribonuclease inhibitor、Random Primer、cDNA合成试剂盒（Takara公司,中国），总RNA提取试剂（Invitrogen公司,美国），DEPC(Promega,美国)，Marker及兔抗大鼠calpain-1抗体、β-Actin、RIPA组织细胞裂解试剂盒(Santa cruz公司,美国)，HRP标记的羊抗鼠IgG(北京中山公司)，ECL试剂盒(Thermo公司,美国)，Bio-Rad DC protein assay试剂盒 (Bio-Rad公司)，PVDF膜(Millipore公司)，Bio-Rad电泳仪及电泳槽及凝胶成像系统Kodak 440CF(Kodak，美国)，荧光倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）等。TUNEL试剂盒(KeyDEN公司)。

1.2 方法

1.2.1 HIBD模型的建立及组织制备 采用改良的Rice法[2]构建新生大鼠HIBD模型，大鼠行颈正中切口，分离左侧颈总动脉后双重结扎，并从两重结扎线中间剪断血管。术后将HIBD组大鼠置于缺氧箱中，持续通入8%O2+92%N2的混合气体2h，气流量1L/min。苏醒后返回母鼠身边继续喂养，代乳后饲养环境一致，假手术组颈总动脉仅分离不结扎不做缺氧处理。HIBD组在设定时点HIBD后2、12、24h及2、3、5、7d断头处死，迅速取出心脏分成2部分，一部分置于液氮中保存备用，另一部分经10%甲醛固定、石蜡包埋后制成切片。假手术对照组与HIBD后2h组同时处死。

1.2.2 TUNEL检测的操作步骤及结果判定 石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水合，0.1mol/L PBS（pH7.4）浸浴15min×2次；封闭液室温固定30min后PBS浸浴15min×2次；透膜液室温浸浴3～5min；玻片在PBS缓冲液中浸浴5min×2次；加TUNEL标记反应混合物20～25μL，湿盒内37℃孵育1h，轻轻摇洗5min×3次；抛去PBS，每张盖玻片加1：1000的HOCHEST染核，暗室内室温孵育10min；再经PBS摇洗5min×3次抛去PBS,经荧光显微镜观察荧光，激发波长450～500nm，发射波长515～565nm，TUNEL混合液中不加TdT的切片作阴性对照，阳性的凋亡细胞核呈绿色，阴性细胞呈蓝色。每切片随机选择10个视野，高倍镜下计数500～1000个细胞中的阳性细胞数，其阳性细胞百分率即为凋亡指数（apoptosis index,AI）。

1.2.3 RT-PCR法测定心肌组织Calpain-1mRNA表达量 按照Trizol试剂说明书在心肌组织中抽取总RNA，逆转录反应得到cDNA后用于PCR扩增。以β-actin作为内参，Rat Actin-bate引物序列：上游引物5′-GGA GATTACTGCCCT GGCTCCTA，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，扩增片段150bp；Calpain-1引物序列：上游引物5′-GGGGTG AAGTGGAGTGGA AAG，下游引物5′-TTA AGGGCGTCAGGT GTA AGG，扩增片段184bp，反应条件：Rat Actin-bate预变性 94℃ 5min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃30s，循环27次，结束循环后再延伸72℃8min；calpain-1预变性94℃5min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃30s，循环35次，结束循环后再延伸72℃5min。PCR产物经2%琼脂糖电泳，分别获得 213bp、298bp和 749bp的条带，应用Bio-Rad凝胶成像及定量扫描仪分析，以目的片段/内参照β-actin片段的条带光密度比值作半定量比较。

1.2.4 Western blot检测Calpain-1蛋白活性 按说明书配制细胞裂解液，以每1g心肌组织加3mL裂解液的比例制成组织匀浆，冰浴1h后4℃离心10min，取上清液。按照说明书配置BCA蛋白测定标准液，应用酶标仪测出样品的吸光度并计算出组织上清液的蛋白含量。蛋白质样品沸水加热10min后置于冰水中冷却，加入10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，再将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上4℃封闭过夜。加入兔抗大鼠Calpain-1抗体37℃孵育2h，洗膜后再加入辣根酶标记羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，加入ECL发光底物用Bio-Rad凝胶成像系统的曝光，PVDF膜于分子量80kD和76kD处显示特异的蛋白信号。应用QuantityOne-4.1.0软件对所得特异性蛋白质条带进行图分析，蛋白质条带的含量以OD值表示，将Calpain活性片段的OD值与总片段的OD值比较即76kD/80kD比值代表Calpain-1蛋白的活性。比值越大，说明阳性反应程度越高，目标蛋白活性越强，反之则表示目标蛋白活性越弱。

2 结果

2.1 大鼠心肌细胞凋亡情况 对照组偶见凋亡细胞，HIBD组凋亡细胞均有明显增加（P<0.01）。与对照组相比，AI自HIBD后2h组开始有明显增加（P<0.01），3d达高峰（P<0.001）后开始降低，7d仍明显高于对照组（P<0.01）。如以对照组AI均数作为基数，HIBD组大鼠AI增加在2.5～19.1倍，尤以HIBD后3d组为著（19.1倍）。如图1、2所示。

图1 对照组（×200）Fig 1 Control group（×200）

2.2 大鼠心肌细胞Calpain-1mRNA、蛋白活性变化 大鼠心肌中Calpain-1mRNA表达量自HIBD后12h增多（P<0.01），2d达高峰，表达量在3～5d仍维持在较高水平（P<0.001）；Calpain-1蛋白在分子量80kD处对照组信号最强，HIBD后逐渐减弱；76kD的信号在对照组最弱，HIBD后逐渐增强，2d时76kD信号强度超过80kD，3d时76kD的信号最强。Calpain-1蛋白活性在HIBD后2h增高（P<0.05），24h～2d显著增高 (P<0.001)，3d达高峰；5d有所下降，7d与对照组相比无统计学差异（P>0.05）。见图3、表1。

图3 对照组及HIBD各时点组蛋白条带Fig 3 Western blot analysis of calpain-1of control and HIBD groups

表1 大鼠心肌组织AI(%)与Calpain-1mRNA、蛋白活性变化（±s）Tab 1 Changes of apoptosis index and expressions of calpain-1gene and protein in myocardium of rats（±s）

表1 大鼠心肌组织AI(%)与Calpain-1mRNA、蛋白活性变化（±s）Tab 1 Changes of apoptosis index and expressions of calpain-1gene and protein in myocardium of rats（±s）

组别对照组HIBD后2h 12h 24h 2d 3d 5d 7d mRNA 0.0363±0.02920.0788±0.02850.1962±0.06500.3525±0.03370.5400±0.08480.3200±0.05150.1825±0.05770.0838±0.0306Calpain-1P 0.1040.0000.0000.0000.0000.0000.07076kD/80kD 0.1001±0.03200.1875±0.03730.1562±0.08870.7200±0.08810.8502±0.10001.0479±0.10930.6752±0.09710.1031±0.0157P 0.0300.1590.0000.0000.0000.0000.937细胞AI(%) 1.5250±0.22813.8500±1.11739.0374±1.420214.7125±2.242723.1750±2.726429.1625±5.14117.5500±2.51054.1125±0.1394P 0.0050.0000.0000.0000.0000.0000.003

2.3 心肌细胞AI与Calpain-1之间相互关系 Calpain-1mRNA、蛋白活性与AI之间呈直线正相关(r=0.786，P=0.000；r=0.853,P=0.000)

3 讨论

细胞凋亡是主动性细胞死亡形式，在维持机体生理稳态和生长发育中发挥着重要作用，同时也参与了众多疾病的病理过程。既往认为心肌细胞、神经细胞等终末细胞不会发生凋亡反应，直到1989年，Nepomniashchikh等观察饥饿性心肌萎缩超微结构时发现，心肌细胞结构蛋白合成降低，细胞数减少，由此初步提出饥饿性心肌萎缩是由细胞凋亡所致。随后Gottlieb和Kawano等采用电镜结合DNA凝胶电泳方法才取得了心肌细胞凋亡的直接证据，同时Tanaka等在培养的心肌细胞中也证实了凋亡的存在。心肌细胞的功能和代谢特点决定了心肌细胞对缺氧非常敏感，大量研究已证实，缺氧能诱导心肌细胞凋亡[3-5]。刘英等[4]采用TUNEL法证实了HIBD过程中心肌细胞凋亡的存在；李刚等[6]利用Annexin-V/PI双染色流式方法证明新生大鼠HIBD发生后心肌细胞存在明显凋亡。

Calpains是钙依赖性蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成员之一，广泛分布于绝大多数哺乳动物组织中。Calpain-1是最早被发现也是研究较清楚的Calpain家族成员之一，胞内Ca2+的浓度为微摩尔时即被激活，并随着Ca2+浓度不同出现的结果也不同。Ca2+浓度逐步提高可导致Calpain-1构象改变，使之具有了蛋白水解酶活性；Ca2+浓度进一步提高Calpain-1将发生自溶，其N端部分氨基酸序列被水解，使Calpain-1的80kD大亚基降解为76kD，此时酶原形式变为活性形式。生理状态下，细胞内的Ca2+浓度总是保持在极低的水平，心肌细胞在缺氧缺血时，钙离子通道开放，钙大量流入细胞，钙泵功能下降，造成细胞内钙超载。对体内及体外各种模型的研究显示，当心肌细胞遇到缺氧、缺血等刺激时，Calpain-1因细胞内钙超负荷而被激活，活化后的Calpain-1作用于细胞骨架蛋白、膜蛋白、钙影蛋白、ATP酶等，产生一系列能诱导细胞凋亡的“信号”载体，使其结构破坏、功能丧失而导致细胞死亡[5，7]。Inserte等[8]发现，Calpain能够在大鼠心脏缺血再灌注早期被激活，通过切割细胞骨架上的fordrin蛋白及ankyrin蛋白，致使锚定于细胞膜的Na+-K+-ATPase脱离，丧失功能，致使[Na+]i无法恢复，[Ca2+]i持续上升，进一步恶化细胞内的离子环境，加重Ca2+超载的程度激活更多的Calpain，形成恶性循环，起始对细胞的损伤过程。陈运清等[9]对风湿性房颤患者研究发现，Calpain-1的含量与心房肌细胞凋亡呈明显正相关，说明Calpain-1与心房肌细胞凋亡密切相关，呈并行关系。本研究应用TUNEL法对HIBD大鼠心肌细胞凋亡进行了检测，发现了不同程度的细胞凋亡，在HIBD后3d组中尤为明显，其凋亡指数较正常心肌细胞增加了19.1倍，且HIBD后7d依然高于正常对照组2.7倍，此结果与刘英等[4]研究结果一致。HIBD后大鼠心肌Calpain-1mRNA及蛋白活性较对照组明显增加，且随着Calpain-1表达的上调，AI亦逐渐增多，两者呈明显正相关；本研究结果表明，缺氧缺血可诱导Calpain-1表达增强，而Calpain-1的过度激活参与了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后心肌细胞凋亡的发生。

Calpain-1的作用底物广泛，它诱导细胞凋亡的途径也是多方面的，主要表现在对凋亡途径的调节。在对HL-1心肌细胞的研究中发现，Ca2+超载时，线粒体膜电位降低的同时伴随着Calpain活性的上调，通过Calpain抗体标记染色发现Calpain出现在线粒体的位置，提示Calpain引起线粒体功能的异常[10]。在各种病理状态下，Calpain被过度激活，一方面参与病理状态的维持与加重；另一方面与内外源性凋亡信号转导途径相互作用，最终导致心肌细胞的凋亡。心肌细胞内Ca2+浓度的增加对Calpain-1的激活起着至关重要的作用，尽管Calpain-1参与了心肌细胞凋亡调节的确切机制尚不十分清楚，但可以肯定的是与缺氧导致的细胞内Ca2+超载有关。细胞内钙超载及其所触发的一系列有害代谢是导致心肌细胞死亡的“最后共同通路”，在细胞凋亡中有重要作用。因此，进一步研究Calpain在细胞凋亡中的作用有助于深入了解细胞凋亡的机制及其在疾病防治中的作用。

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