清咽滴丸抗柯萨奇病毒B3,B5的实验研究

迟 玮，陈 霞，王小龙，褚玉晶，李志媛，李晓眠

（天津医科大学微生物学教研室，天津300070）

清咽滴丸是一种高效、速效中药制剂，具有疏风清热、解毒利咽、消肿止痛的作用。在现代药理学研究中显示出对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有一定的抑菌作用[1]。同其它一些中药口含片相比，清咽滴丸的抑菌效果较显著[2]，且稳定性好，无不良反应[3]。柯萨奇病毒B3（CVB3）是病毒性心肌炎的主要病原[4-5]，病毒持续感染可导致扩张型心肌病[6-7]。柯萨奇病毒B5（CVB5）主要引起脑炎、心肌炎、心包炎、腹膜炎、肝炎、睾丸炎、疱疹性咽峡炎等，偶见皮疹[8]。本研究旨在探讨清咽滴丸在体外（细胞水平及血清水平）对CVB3、CVB5的治疗作用，为筛选新型抗病毒药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞 CVB3（Nancy株），CVB5（Kauchker株），Vero细胞株均为本实验室保存。

1.1.2 药物 清咽滴丸由天津中新药业集团股份有限公司第六中药厂生产，国药准字号Z10930004；病毒灵由山西太原药业有限公司生产，国药准字号H14023460。

1.1.3 实验动物 雄性健康SD大鼠6只，体重均约250g，购自中国医学科学院放射医学研究所医学实验动物中心。

1.1.4 主要试剂和仪器 RPMI-1640培养基(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma)；二甲基亚砜（天津大学科威公司）；96孔培养板(Costar)；CO2培养箱 (美国Thermo Forma，3111型)；倒置显微镜(德国Zeiss，Axiorert 200)；酶标仪（Multiskan Mk3，Thermo Labsystems）。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度测定 根据Reed-Muench法计算CVB3、CVB5的半数组织感染剂量（TCID50）。实验用病毒浓度为100TCID50。

1.2.2 药物毒性测定 取对数生长期的Vero细胞100μL/孔接种在96孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中24h，待细胞长成单层，弃培养液。连续倍比稀释药液，浓度分别为2×10-2g/mL、1×10-2g/mL、5×10-3g/mL、2.5×10-3g/mL、1.25×10-3g/mL、6.25×10-4g/mL、3.125×10-4g/mL、1.56×10-4g/mL、7.81×10-5g/mL、3.91×10-5g/mL，每稀释度4孔，另设正常细胞对照组。培养72h，每日在倒置显微镜下观察细胞变化，记录CPE[9]。

1.2.3 细胞水平上清咽滴丸对CVB3、CVB5的作用

1.2.3.1 治疗法：在病毒吸附细胞2h后加入清咽滴丸最大无毒浓度的0.5倍、1倍、5倍、10倍、20倍浓度药液[10]，每个浓度4孔，另设有病毒对照组、病毒灵对照组、正常细胞对照组。培养72h，MTT法[11]测定细胞存活率，计算抑制率。病毒抑制率(%)=(药物处理孔A值-病毒对照孔A值)/(细胞对照孔A值-病毒对照孔A值)×100%。

1.2.3.2 同时法：将清咽滴丸最大无毒浓度的0.5倍、1倍、5倍、10倍、20倍浓度药液分别与病毒混合，接种到培养板上，每个浓度4孔，另设病毒对照组、病毒灵对照组、正常细胞对照组。培养72h，MTT法测定细胞存活率，计算抑制率。

1.2.4 血清水平上清咽滴丸对CVB3、CVB5的作用

1.2.4.1 含药血清的制备：清咽滴丸按100mg/kg（相当于成人临床推荐剂量的6倍）给大鼠灌胃，给药前禁水禁食12h。灌胃前第1次内眦采血，灌胃后25min第2次采血，以后每隔20min采血1次，每次取血约1.5mL，共6次。无菌分离血清，56℃，30min灭活后，将每个时间点血清样本分别用细胞维持液稀释成1:2、1:4、1:6、1:10、1:16，-20℃冻存。

1.2.4.2 最适血清浓度测定：不同时间点不同稀释度的含药血清按每孔100μL加到单层Vero细胞孔中，每个浓度设4孔，另设正常血清对照组、病毒对照组、病毒灵对照组。培养72h，每日在倒置显微镜下观察细胞变化，记录CPE。

1.2.4.3 含药血清对CVB3、CVB5的抑制作用：将每个时间点血清样本分别用细胞维持液稀释成1∶10，按每孔100μL加到单层Vero细胞孔中，每浓度设4孔，同时分别用100μL 100TCID50CVB3、CVB5感染细胞，另设正常血清对照组、病毒对照组、病毒灵对照组。培养72h，MTT法测定细胞存活率，计算抑制率。

1.3 统计学方法 采用统计软件SPSS 11.0对数据进行ANOVA单因素方差分析，各组间两两比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 Vero细胞形态学变化 正常Vero细胞为梭形或多边形，排列整齐紧密，呈上皮样，胞浆清楚，折光性好。CVB3或CVB5接种于Vero细胞上第1～2天出现细胞病变，细胞变小呈椭圆形或树枝状，细胞内颗粒增多，折光性变差，3d后几乎全部固缩、死亡、脱落，悬浮在培养液表面。清咽滴丸、病毒灵及含药血清均是直接使细胞变小变圆，高浓度时直接抑制细胞增殖、导致细胞迅速死亡。

2.2 病毒滴度 CVB3：TCID50=10-7.4，CVB5：TCID50= 10-7。

2.3 药物毒性 不同浓度的清咽滴丸接种于细胞72h后，7.81×10-5g/mL及其以下浓度未见细胞出现明显形态变化，故清咽滴丸的最大无毒浓度（TC0）为7.81×10-5g/mL。同理可知，病毒灵的TC0为6.25×10-4g/mL。

2.4 细胞水平上清咽滴丸对CVB3、CVB5的作用

2.4.1 清咽滴丸对CVB3的作用 由表1可知在同时法中加入TC0（7.81×10-5g/mL）清咽滴丸组能明显抑制病毒增殖，与病毒对照组差别有统计学意义（P<0.05），其余4个清咽滴丸组与病毒对照组差别无统计学意义（P>0.05）。镜下观察的结果跟统计结果一致，说明清咽滴丸有抑制CVB3感染细胞的作用，且7.81×10-5g/mL清咽滴丸组效果最好。

表1 不同给药方法清咽滴丸抗CVB3的病毒抑制率（%）Tab 1 Inhibition ratio of Qingyan diwan to CVB3through different given methods（%）

在治疗法中加入5TC0（3.91×10-4g/mL）清咽滴丸组对病毒的治疗作用最好，与病毒对照组差别有统计学意义（P<0.05），其余4个清咽滴丸组与病毒对照组差别无统计学意义（P>0.05）。镜下观察的结果跟统计结果一致，说明清咽滴丸有治疗CVB3感染细胞的作用，且3.91×10-4g/mL清咽滴丸组效果最好。

2.4.2 清咽滴丸对CVB5的作用 由表2可知在同时法中加入TC0（7.81×10-5g/mL）和0.5TC0（3.91×10-5g/mL）清咽滴丸组能明显抑制病毒增殖，与病毒对照组差别有统计学意义（P<0.05），其余3个清咽滴丸组与病毒对照组差别无统计学意义（P>0.05）。镜下观察的结果跟统计结果一致，说明清咽滴丸有抑制CVB5感染细胞的作用，且7.81×10-5g/mL清咽滴丸组效果最好。

在治疗法中加入0.5TC0（3.91×10-5g/mL）清咽滴丸组对病毒的治疗作用最好，与病毒对照组差别有统计学意义（P<0.05），其余4个清咽滴丸组与病毒对照组差别无统计学意义（P>0.05）。镜下观察的结果跟统计结果一致，说明清咽滴丸有治疗CVB5感染细胞的作用，且3.91×10-5g/mL清咽滴丸组效果最好。

表2 不同给药方法清咽滴丸抗CVB5的病毒抑制率（%）Tab 2 Inhibition ratio of Qingyan diwan to CVB5through different given methods（%）

统计结果显示同种给药方法中，清咽滴丸抑制CVB3和CVB5增殖或治疗CVB3和CVB5的感染的结果差异无统计学意义（P>0.05）。

2.5 血清水平上清咽滴丸对CVB3、CVB5的作用

2.5.1 最适血清浓度测定 由观察的细胞病变情况可知，同一浓度不同时间含药血清的作用效果类似，含清咽滴丸血清在稀释度为1:10以上时对细胞的毒性作用明显减轻，故最适清咽滴丸血清浓度为1:10。

2.5.2 含药血清对CVB3、CVB5的抑制作用 含药血清在65min组和105min组时抑制CVB3增殖显著，细胞存活良好，与病毒对照组差别有统计学意义（P<0.05），但与病毒灵对照组差别无统计学意义（P>0.05）；其余4组含药血清与病毒对照组差别无统计学意义（P>0.05）。含药血清在65min组、85min组和105min组时抑制CVB5增殖显著，细胞存活良好，与病毒对照组差别有统计学意义（P< 0.05），但与病毒灵对照组差别无统计学意义（P> 0.05）；其余3组含药血清与病毒对照组差别无统计学意义（P>0.05）。提示清咽滴丸在大鼠体内药物浓度的峰值在65～105min之间，且抑制病毒增殖的效果与病毒灵几乎没有差别。见表3。

表3 含药血清对CVB3、CVB5的抑制作用Tab 3 Inhibited effect of drug-contained serum to CVB3and CVB5

3 讨论

柯萨奇病毒属小核糖核酸病毒科，肠道病毒属。柯萨奇B组病毒是引起感冒、疱疹性咽炎、无菌性脑膜炎、病毒性心肌炎、心包炎等多种疾病的病原，经呼吸道、消化道传播。由该组病毒引起的心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎等疾病死亡率都很高，对人群潜在危险很大。目前，常用的抗病毒药病毒灵虽然可有效抑制病毒复制，但病毒灵属核苷类似物，毒性较大，甚至有致畸作用。因此，寻找更加安全有效的抗病毒药物势在必行。

清咽滴丸是治疗咽喉疾病的良药，主选牛黄清热解毒为君药，青黛清热解毒凉血、薄荷疏风清热、冰片利咽散火止痛，三药辅牛黄为臣药；诃子入肺经，利咽散火，止咳解毒治失音为佐药；甘草清热利咽，调和诸药，益气和中为使药[12]。诸药合用具有疏风清热、解毒利咽、消肿止痛功效，用于治疗风热喉痹、咽痛、咽干、口渴或微恶风、发热、咽部红肿、舌边尖红等急、慢性咽炎等症。

根据以上的实验结果，细胞水平实验证明清咽滴丸具有很强的直接杀灭CVB3和CVB5的作用，并且对CVB3和CVB5的治疗作用效果显著。在一定范围内清咽滴丸对CVB5的抑制率随药物浓度的降低而增强。

中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验技术[13]。该方法可以在某种程度上克服中药本身理化性质的不确定因素对实验结果的影响。以上的实验结果证明，在一定范围内，随着血药浓度的增加，其对细胞的毒性作用增强。通过比较同一浓度梯度下，不同时间段含药血清的抑制作用可知，清咽滴丸在大鼠体内药物浓度的峰值在65～105min之间。

同时发现，病毒灵对于CVB3和CVB5的抑制作用及治疗作用均很显著。而清咽滴丸与病毒灵的抑制作用及治疗作用几乎没有差别，但最适血清浓度测定中CPE结果表明一定浓度的清咽滴丸对Vero细胞的毒性远小于病毒灵，提示用安全有效的中药代替病毒灵治疗病毒具有可行性，拥有美好的前景。

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