胃肠安丸抗轮状病毒作用的体外试验

张 婧，周洪经，李晓眠

（天津医科大学微生物学教研室，天津 300070）

轮状病毒(rotavirus,RV)属呼肠孤病毒科，是婴幼儿急性感染性腹泻的主要病原体，占婴幼儿腹泻的50%[1]。目前无有效的西药治疗[2]。胃肠安丸为纯中药制剂，处方由木香、沉香、厚朴等11味药组成。现代药理学实验证明其有明显的抗腹泻作用，对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌及痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍氏志贺菌等8株菌种均有明显的杀菌作用，还对致病病毒的基因有一定影响，可达到降解病毒核酸的目的，与西药相比具有明显的优势[3]。本研究旨在探讨胃肠安丸在体外对RV的治疗作用，为筛选新型抗轮状病毒的中成药提供实验和应用基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株与细胞株 猴轮状病毒SA11株，非洲恒源猴肾细胞（MA104细胞）（天津医科大学微生物学教研室提供）。

1.1.2 药物 胃肠安丸由天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂提供，国药准字Z10880010。

1.1.3 实验动物 SPF级雄性健康Wistar大鼠,体重均约250g，购自中国医学科学院放射研究所医学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK（津）实验动物2005-001。

1.1.4 试剂和仪器 DMEM-HG培养基 (Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Hyclone)，四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma），96孔细胞培养板（BIOFIL公司）, CO2培养箱（美国Thermo Forma，3111型），倒置显微镜（德国Zeiss，Axiorert 200），酶标仪（Multiskan Mk3,Thermo Labsystems公司），高速离心机（Beckman coulter）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MA104细胞在含10%胎牛血清的DMEM-HG培养基，于37℃，5%CO2孵箱中培养传代。

积极的激励性外部环境能促进提升一般创造力。组织营造积极的激励性外部环境条件，如塑造组织整体的创新氛围、明确阐明整体任务目标、给予经常性的关于如何改进工作的反馈、提供强有力的团队支持、实施鼓励性监督、创造信任的工作关系、较多的知识共享空间、给予足够的资源，等等，都可以形成良好的外部环境，提升个体一般创造力。与此同时，减少消极的外部环境，如过多的工作量和紧急期限、竞争性绩效、可预见的负面评价、教条的组织结构，以及开展工作的种种限制等，则可以大大减小消极性外部环境因素对一般创造力的影响。

1.2.2 病毒的传代及毒力测定 SA11株解冻，乙酰胰酶37℃处理病毒悬液1h，用磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞瓶中MA104细胞单层洗3遍，加入胰酶处理过的SA11株1mL，37℃，5%CO2孵箱中吸附1.5h，加入10mL含5μg/mL胰酶的DMEM-HG培养基，37℃，5%CO2孵箱中培养，当细胞出现病变达“+++”后，冻融2次，4000r/min离心10min，取上清，-70℃保存。SA11株在MA104细胞上多次传代提高病毒毒力，待毒力稳定后用于实验。按病毒致细胞病变作用（CPE）终点稀释法，在96孔细胞培养板上滴定半数组织培养感染量（TCID50）为10-6.3[4]。本实验用100TCID50/0.1mL。

1.2.3 SA11株电镜观察

1.2.3.1 病毒的提纯：取经冻溶3次的SA11株80mL，8000r/min，30min，取上清70mL，27000r/min，2h，弃上清，用1mL DMEM-HG培养基悬浮沉淀。

1.2.3.2 透射电镜标本的制备和电镜观察：经高速离心的病毒悬浮液滴在具有Formvar支持膜的300目铜网上，1～2min后用滤纸靠近铜网边缘，吸去铜网上的液体，用pH7.4的20g/L的磷钨酸负染1min，用滤纸吸走多余染液，干燥后在透射电镜（电镜型号：Philips EM400ST）下进行观察，每份标本观察1～2个铜网，并照相[5]。

1.2.4 SA11株dsRNA的检查 按Z.E.N.A病毒RNA试剂盒说明书操作。提取的SA11株dsRNA用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）4h，凝胶用硝酸银染色检查dsRNA图型。

1.2.5 药物的配制 取胃肠安丸药物1g乳钵中研碎，放刻度离心管中加水至10mL，水浴煮沸20min，离心2000r/min，10min，取上清，4℃冰箱保存备用。1.2.6药物毒性测定 取对数生长期浓度每毫升为105的MA104细胞悬液100μL/孔接种于96孔细胞培养板，37℃，5%CO2孵箱培养24h，在单层细胞上分别加入不同浓度的药物（10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01mg/mL），每孔100μL，每组设4个复孔，同时设正常细胞对照。37℃，5%CO2孵箱培养72h，每日观察细胞变化，记录CPE、MTT法检测细胞存活率，计算药物的最大无毒浓度（TC0）和半数毒性浓度（TC50）。

1.2.7 细胞水平上胃肠安丸对SA11株的作用

1.2.7.1 药物对病毒感染的预防作用：用不同浓度药物预先处理96孔细胞板中的单层MA104细胞1.5h，PBS洗涤后加入经胰酶处理过的100TCID50/ 0.1mL的SA11株100μL/孔。吸附1.5h后弃去，加100μL/孔的DMEM-HG培养基维持，每组设4个复孔，同时设正常细胞对照和病毒对照。37℃，5% CO2孵箱培养，每日观察，72h后用MTT法检测细胞存活率，计算抑制率[4]。

1.2.7.3 药物对病毒感染的直接灭活作用：将不同浓度的药物与经胰酶处理过的100TCID50/0.1mL的SA11株各100μL，混合作用1.5h后接种在用PBS洗涤过的96孔细胞培养板的细胞上，吸附1.5h后弃去，加100μL/孔的DMEM-HG培养基维持，同上法培养与检测。

1.2.7.4 每组实验重复3次。

1.2.8 血清水平上胃肠安丸对SA11株的作用

1.2.8.1 含药血清的制备：取浓度为2.4mg/mL的胃肠安丸1mL（相当于成人临床推荐剂量的6倍）给大鼠灌胃，给药前禁食禁水12h，灌胃前第1次内眦采血。灌胃后25min第2次采血，以后每隔20min采血1次，每次取血约1.5mL，共6次。分离血清，56℃，30min灭活后用0.22μm的滤器除菌，将每个时间点血清样本分别用DMEM-HG培养基稀释1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，-20℃保存。

1.2.8.2 最适血清浓度测定：不同浓度的大鼠含药血清按100μL/孔接种在用PBS洗涤过的单层MA104细胞的96孔细胞培养板上，同时用100TCID50/0.1mL的SA11株感染细胞，另设等梯度浓度的正常血清组，病毒对照组，37℃，5%CO2孵箱培养72h，每日观察细胞变化，记录CPE。

1.2.8.3 含药血清对SA11株的抑制作用：将不同时间点采集的大鼠含药血清分别用DMEM-HG培养基稀释至最适血清浓度，按100μL/孔接种在用PBS洗涤过的单层MA104细胞的96孔细胞培养板上，同时用100TCID50/0.1mL的SA11株感染细胞，另设正常血清组，病毒对照组，37℃，5%CO2孵箱培养72h，每日观察细胞变化，MTT法检测细胞存活率，计算抑制率。

1.2.9 分析方法 MA104细胞病变程度判定标准（CPE记录方法）：“+”为细胞病变25%以下；“++”为细胞病变25%～50%；“+++”为细胞病变50%～75%；“++++”为细胞病变75%以上。细胞存活率（%）=（实验组A570值-空白对照组A570值）/（正常细胞对照组A570值-空白对照组A570值）×100%；病毒抑制率（%）=（药物处理组A570值-病毒对照组A570值）/（细胞对照组A570值-病毒对照组A570值）×100%。根据Reed-Muench法计算药物对细胞的TC50和药物对

病毒的半数抑制浓度（IC50），治疗指数（TI）=TC50/IC50。运用SPSS11.5统计软件进行统计，所有数据均以±s表示。多组数据间的比较用one-wayANOVA进行比较；抑制率(或细胞存活率)与药物浓度间的关系用Probit回归分析。采用TI作为评价指标来衡量药物对病毒抑制的效力。指数大于1为有效，指数越大，安全范围越大[6]。

2 结果

2.1 SA11株电镜观察结果 电子显微镜下，绝大部分SA11株呈实心颗粒，形态完整，结构清晰，呈车轮状 (具有辐条状结构及一个非常清晰平滑的周边)。少部分病毒出现空心颗粒（图1）。

图1 轮状病毒SA11株经高速离心提纯后电镜观察结果Fig 1 Results of electron microscopy of Rotavirus SA11strain purified by high speed centrifugation

2.2 轮状病毒核酸（dsRNA） 用PAGE检查dsRNA有清晰的典型的A群轮状病毒SA11株病毒核酸电泳图型（4：2：3：2）（图2）。

图2 SA11株病毒核酸PAGE电泳图型Fig 2 Virus nucleic acid PAGE electrophoresis of SA11strain

2.3 药物毒性 不同浓度胃肠安丸接种于细胞72h，0.625mg/mL及其以下浓度未见出现明显细胞毒性改变，即胃肠安丸的TC0为0.625mg/mL。TC50为1.25mg/mL。测定的MTT值进一步验证了该结果。

2.4 细胞水平上胃肠安丸对SA11株的作用 在预防、治疗和直接灭活作用中胃肠安丸浓度为0.625mg/mL时能明显抑制病毒增殖，浓度为0.313mg/mL、0.16mg/mL、0.08mg/mL时效果次之。统计结果显示在预防、治疗和直接灭活作用中胃肠安丸为上述浓度时与病毒对照组差别有统计学意义（P<0.05）。镜下观察的结果跟统计结果一致，说明胃肠安丸有抑制SA11感染细胞的作用，且胃肠安浓度为0.625mg/mL时效果最好。见表1。

表1 胃肠安丸抗轮状病毒作用 （±s）Tab 1 The anti-rotavirus activity of Weichang’an pill（±s）

表1 胃肠安丸抗轮状病毒作用 （±s）Tab 1 The anti-rotavirus activity of Weichang’an pill（±s）

与病毒对照组比较*P＜0.05

胃肠安丸浓度(mg/mL）0.010.020.040.080.160.3130.625病毒对照组正常细胞对照组IC50(mg/mL) TI预防作用 治疗作用 直接灭活作用A值A值A值0.453±0.0180.460±0.0420.477±0.0550.563±0.003* 0.663±0.002* 0.783±0.003* 0.806±0.003* 0.450±0.0030.981±0.004抑制率（%）0.611.915.2021.2140.1262.7767.05抑制率（%）1.792.905.0921.3140.0362.6867.02抑制率（%）3.9228.1046.6157.4060.2163.9771.24－－0.460±0.0460.466±0.0580.478±0.0480.564±0.003* 0.663±0.002* 0.783±0.003* 0.806±0.003* 0.451±0.0030.981±0.004－－0.451±0.0650.585±0.065* 0.687±0.002* 0.746±0.004* 0.761±0.004* 0.782±0.003* 0.823±0.002* 0.430±0.0050.981±0.004－－－－0.2614.79－－0.2694.67－－0.11410.96

2.5 血清水平上胃肠安丸对SA11株的作用

2.5.1 最适血清浓度测定 镜下结果表明同一时间不同浓度大鼠含药血清的作用效果类似，正常血清在稀释度为1∶8以上时对细胞的毒性作用减轻。含胃肠安丸的血清稀释度在1∶2、1∶4时，表现同正常血清对细胞的毒性作用。1∶16含药血清与病毒对照组细胞形态有明显差别，表现出对细胞的保护作用，且此时血清的毒性作用小。

2.5.2 含药血清对SA11株的抑制作用 含药血清45min组和65min组时细胞状态优于病毒对照组和含药血清的其它各组，抑制SA11株增殖显著,细胞存活良好。统计结果显示含药血清各组均与病毒对照组、正常血清组差别有统计学意义（P<0.05）。见 表2。

表2 不同时间含药血清对病毒的抑制率（%）Tab 2 The viral inhibition of the concentration of drug in serum at different times（%）

用MTT法测得含胃肠安丸血清对轮状病毒的抑制率，绘制时间—效应曲线（图3），表明含药血清对轮状病毒的抑制作用与药物在体内的代谢时间有关。在给药后45～65min之间，药物在血清中浓度最高。

图3 胃肠安丸含药血清时间—效应曲线Fig 3 The time-effect curve of concentration of Weichang’an pill in serum

3 讨论

RV是引起急性感染性腹泻的主要病原体。据美国疾病控制中心报告，每年全世界感染轮状病毒者有2亿人，因RV感染而死亡的超过100万人[7]。它是婴幼儿急诊和死亡的第二大疾病，严重威胁人类健康,是世界卫生组织和我国重点防治的疾病之一。由RV引起的腹泻占我国腹泻病的50%。目前，对RV治疗药物,主要是对症治疗。中药对腹泻的治疗有一定的优势。胃肠安丸具有芳香化浊，理气止痛，健胃导滞的功能，用于消化不良引起的腹泻、肠炎、菌痢、脘腹胀满、腹痛、食积乳积。临床用胃肠安丸治疗RV感染性腹泻，疗效显著[8-9]。本实验研究了胃肠安丸及血清体外抗RV的作用，结果显示：胃肠安丸血清可增强MA104细胞的抗RV感染的作用，对RV感染的MA104细胞有显著的预防、治疗和直接灭活作用，可降低RV的毒力，削弱其感染能力。

RV属呼肠孤病毒科，根据内层壳衣中VP6蛋白上抗原的差异，被分为A、B、C、D、E、F、G 7组，RV有很强的宿主局限性[10]。感染人类的主要为A、B组，病毒与靶细胞的结合是病毒感染的关键，阻断病毒对靶细胞的吸附可减弱病毒的毒力。我们的实验证实胃肠安丸血清能提高细胞抗SA11株病毒感染的能力，降低病毒的毒力，可能是减弱病毒对靶细胞的吸附，降低细胞与病毒亲和力的双重作用。鉴于国内外对胃肠安丸研究甚少，所以对感染后的细胞抗RV的机制还知之甚少，尚待进一步研究。本结果表明，胃肠安丸可提高细胞对RV的耐受，降低病毒的毒力。由此可推测胃肠安丸可减轻RV对靶细胞的感染。为临床胃肠安丸治疗腹泻提供了理论基础和临床应用依据。

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