PUMA和caspase-3在结直肠癌中的表达及意义

王文娟，高玉彤

（天津医科大学病理学教研室，天津300070）

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。关于其发生机制，目前还不是很清楚，至少部分研究显示细胞凋亡调控失常与结直肠癌的发生有一定的关系[1]。PUMA是新近发现的凋亡调控基因，属于Bcl-2家族中的成员，可通过依赖P53途径或非依赖P53途径促进细胞凋亡[2]。研究显示PUMA的表达下降或缺失参与肿瘤发生，如胰腺癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤[3-4]，关于PUMA在结直肠癌发生中作用的研究报道少见。Caspase-3是细胞凋亡通路的关键酶之一，在结直肠癌发生中的表达情况还有争议。本研究通过检测PUMA和caspase-3在结直肠癌及腺瘤中的表达情况，分析其与结直肠癌临床病理参数之间的关系，探讨两者在结直肠癌发生发展中的作用，以期为结直肠癌早期诊断和临床治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料 收集天津医科大学总医院2006年1月～2008年12月期间手术切除、经病理证实为结直肠癌和腺瘤的标本80例，其中结直肠癌60例，结直肠腺瘤20例；选取距离肿瘤10cm以上结直肠黏膜作为正常对照，共计44例。结直肠癌患者中男性35例，女性25例；年龄21～81岁，中位数年龄70.5岁；临床病理参数（1）组织学分级：高分化腺癌20例（33.3%）；中分化腺癌33例（55.0%）；低分化腺癌7例（11.7%）。（2）淋巴结转移：有转移28例（46.7%）；无转移32例（53.3%）。（3）Dukes分期：A+ B 33例（55.0%）；C+D 27例（45.0%）。（4）浸润深度：未侵出浆膜39例（65.0%）；侵出浆膜21例（35.0%）。

1.2 主要试剂 兔抗人PUMA多克隆抗体（浓缩型）购自武汉博士德生物工程公司，工作浓度1∶50；兔抗人caspase-3多克隆抗体（即用型），购自北京中杉金桥生物公司。PV-6000通用型两步法免疫组化检测试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 实验方法 采用免疫组化PV两步法。石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS液浸泡5min；微波抗原修复，中火，3min×2次，自然冷却至室温，PBS液冲洗；3%过氧化氢甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，10min，PBS液冲洗；滴加一抗，4℃冰箱过夜，PBS冲洗；滴加通用型二抗（PV-6000），37℃温箱孵育40min，PBS冲洗；DAB显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。每批染色均设阳性对照和阴性对照。

1.4 结果判断 PUMA和caspase-3阳性染色均为胞浆着色，按半定量积分法[5-6]判断阳性结果。根据阳性细胞染色强度及阳性百分率分别计分，染色强度:不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分率：阴性记为0分，阳性细胞≤10%记为1分,11%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分。两项评分相乘≥2分记为阳性（+），＜2分记为阴性（－）。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行数据统计学分析，率的比较应用χ2检验，相关性分析应用计数资料列联表的相关分析，双侧检验水准，α=0.05。

2 结果

2.1 PUMA在结直肠癌中的表达 PUMA阳性染色定位于胞浆中，正常结直肠黏膜组PUMA的表达高于结直肠腺瘤、结直肠癌组，3组之间表达差异有统计学意义（χ2=12.183，P<0.01）；正常结直肠黏膜组与结直肠腺瘤组之间差异有统计学意义（χ2=6.247，P<0.05）；正常结直肠黏膜组和结直肠癌组之间差异有统计学意义(χ2=10.475，P<0.01）；结直肠腺瘤组与结直肠癌组之间差异无统计学意义（χ2=0.019，P>0.05），见表1、图1a、1b。

表1 PUMA在正常黏膜、腺瘤、结直肠癌组织中的表达Tab 1 Expression of PUMA in normal mucosa,adenoma and colorectal cancer

图1 PUMA 在正常黏膜和腺癌中的表达Fig1Expression of PUMA in normal mucosa and adenocarcinoma

2.2 Caspase-3在结直肠癌中的表达 Caspase-3阳性染色定位于胞浆中，正常黏膜组caspase-3的表达高于结直肠腺瘤、结直肠癌组，3组之间表达差异有统计学意义（χ2=12.785，P<0.01）；正常结直肠黏膜组与结直肠腺瘤组之间差异有统计学意义（χ2=8.145，P<0.01）；正常结直肠黏膜组与结直肠癌组之间差异有统计学意义（χ2=12.613，P<0.01）；结直肠腺瘤组与结直肠癌组之间差异无统计学意义（χ2=0.076，P>0.05），见表2、图2a、2b。

表2 Caspase-3在正常黏膜、腺瘤、结直肠癌组织中的表达Tab 2 Expression of caspase-3in normal mucosa,adenoma and colorectal cancer

图2 Caspase-3在正常黏膜和腺癌中的表达Fig 2 Expression of caspase-3in normal mucosa and adenocarcinoma

2.3 PUMA表达与结直肠癌临床病理参数的关系 在结直肠癌中，PUMA的表达与肿瘤的大小有关，肿瘤最大直径>5cm组阳性表达率低于肿瘤最大直径≤5cm组，差异有统计学意义（χ2=6.514，P<0.05），与患者的年龄、性别、肿瘤发生部位、分化程度、浸润深度、临床分期无明显相关。见表3。

2.4 Caspase-3表达与结直肠癌临床病理参数的关系 Caspase-3表达与患者的年龄、性别、肿瘤发生部位、肿瘤大小、临床分期、浸润深度无关，在中低分化组略高于高分化组，但差异无统计学意义（χ2=0.846，P>0.05）。见表3。

表3 PUMA和caspase-3蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系Tab 3 The relationship between PUMA,caspase-3expression and clinicopathologic features of colorectal cancer

2.5 PUMA与caspase-3的相关性分析 结直肠癌中PUMA阴性表达的41例患者中，有18例csapase-3阴性表达，两者表达呈正相关（r=0.329，P<0.05）。见表4。

表4 PUMA、caspase-3表达的相关性分析Tab 4 The correlative analysis on PUMA and caspase-3expression

3 讨论

3.1 PUMA与结直肠癌 PUMA是2001年Yu、Nakano及Han 3个研究小组同时发现的促凋亡基因，属于Bcl-2家族中的BH3亚家族中的一员。PUMA基因定位于19q，主要通过转录子PUMAα、β发挥促凋亡的作用，它可依赖P53途径或非依赖P53途径促进细胞凋亡。研究显示，PUMA与肿瘤的发生有关，有动物实验发现，RNA干扰技术通过阻断P53诱导的细胞凋亡作用，抑制PUMA基因表达，促进Eμ-myc诱导的淋巴瘤的形成，Bim基因缺失小鼠丧失PUMA基因表达后，会加强小鼠淋巴组织增生并向恶性转化。在缺氧诱导的肿瘤模型中，PUMA丢失促成染色体的不稳定性，增加肿瘤的发生机率。研究显示大约40%的Burkitt’s淋巴瘤出现PUMA基因表达缺失，这可能与DNA甲基化作用有关[7]。Karst等[8]用组织芯片和免疫组化技术研究原发性黑色素瘤、转移性黑色素瘤及不典型增生组织中PUMA的表达水平，发现原发性黑色素瘤明显弱于不典型增生组织，转移性黑色素瘤PUMA表达弱于原发黑色素瘤组织，肿瘤组织中PUMA的表达可以作为患者5年生存率的预测指标。陈鑫等[9]应用RT-RCR技术检测PUMA mRNA在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平，发现PUMA 4种不同剪切体（PUMA-α,-β,-γ及-δ）在癌组织中表达下调，与癌的发生呈负相关。

本研究发现，在结直肠癌发生过程中，PUMA在正常黏膜组的表达高于结直肠腺瘤、结直肠癌组（P<0.05），结直肠腺瘤组和结直肠癌组之间差异无统计学意义（P>0.05），提示PUMA可能参与结直肠癌的发生，并在早期阶段起作用。PUMA表达率与肿瘤的大小有关，在≤5cm肿瘤组织中阳性率较高（18/44），在＞5cm肿瘤组织中阳性率较低（1/16）,表明PUMA表达减少，肿瘤细胞凋亡减少，体积相对较大。PUMA阳性表达与结直肠癌其它病理参数无明显相关，提示PUMA与结直肠癌进展及预后关系不大，这与Jansson等[10]的研究结果基本一致。研究表明，结直肠癌发生与正常黏膜隐窝干细胞突变有关，干细胞中APC基因失活会诱发小鼠肠道肿瘤形成，PUMA依赖P53凋亡途径清除基因突变的干细胞，抑制肿瘤发生。此外，炎症反应是结直肠癌发生的重要因素，免疫细胞释放的活性物质造成细胞DNA损伤，炎症因子TNF-α及ROS、ER应激反应都可通过P53非依赖途径诱发PUMA生成，清除损伤的上皮细胞，防止肿瘤发生[11]。Qiu等[12]利用(AOM)/dextran sulfate sodium salt model动物模型发现，在结肠隐窝干细胞的部位，AOM水平提高了，PUMA基因的表达及PUMA介导的凋亡作用也会增加，而且在APC(Min/+)小鼠模型中，PUMA缺失会促使末端小肠和结肠自发性大腺瘤及微腺瘤的形成。我们推测当各种体内或体外因素造成正常肠道细胞受损时，PUMA发挥促凋亡作用，清除受损细胞，抑制肿瘤发生。如果该途径受到干扰，则导致肿瘤的发生。

3.2 Caspase-3与结直肠癌 Caspsae-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的一员，执行细胞凋亡的关键酶之一，大多细胞凋亡途径都通过caspase-3引发细胞凋亡[13]。Caspase-3作为细胞凋亡的最终执行者，可能参与多种肿瘤的发生。Sun等[14]报道肝癌癌旁正常组织caspase-3表达高于肝癌组织，且高分化者caspase-3表达高于低分化者，caspase-3参与肝癌的去分化过程，它与肝癌的发生发展有关。Hsia等[15]研究食管癌发现，caspase-3高表达可作为判断食管癌良好预后的指标。在结直肠癌变过程中，caspase-3的表达情况国内外文献报道不一，仍有争议。Guan等[16]发现腺瘤中caspase-3表达显著高于结直肠癌组（P<0.05）。也有学者认为caspase-3在结直肠癌中的表达高于正常黏膜，且与肿瘤复发相关，尤其以右侧结肠明显[17]。本研究发现，在正常黏膜-腺瘤-结直肠癌转化序列中，caspase-3阳性表达呈下降趋势，腺瘤组与结直肠癌组阳性表达低于正常黏膜组（P<0.05），腺瘤组与结直肠癌组差异无统计学意义，提示caspase-3表达降低使细胞凋亡减少，在结直肠癌发生的早期阶段发挥作用。本研究显示caspase-3在结直肠癌中阳性表达与患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、临床分期、浸润深度无明显相关，提示caspase-3与结直肠癌的进展及预后无关。也有文献报道，caspase-3与结直肠癌的分化程度有关，癌组织分化程度越高，凋亡活性越强。我们推测研究结果的不一致可能与样本量的大小、所选用的研究方法等因素有关。Caspase-3与结直肠癌发生发展的关系还需要进一步研究以明确其作用机制。

3.3 PUMA与caspase-3PUMA主要通过促进细胞凋亡发挥抑癌作用，本研究表明，在结直肠癌中PUMA与caspase-3呈正相关。无论依赖还是非依赖P53途径，PUMA通过线粒体通路促进细胞凋亡，PUMA与抗凋亡基因Bcl-2结合，将促凋亡基因Bax或Bim置换出来，激活Bax或Bim,Bax或Bim形成寡聚体，诱导线粒体释放细胞色素C,激活procaspase-9和procaspase-3,引起细胞凋亡[18]。因此推测，PUMA表达下调，caspase-3活性下降，细胞凋亡受抑制，参与结直肠癌的发生。

综上所述，本研究表明PUMA和caspase-3可能是结直肠癌发生过程中的早期事件，但未显示其参与肿瘤的进展，是否参与结直肠癌的进展还有待进一步研究，PUMA通过细胞凋亡作用抑制肿瘤发生，这可能为临床肿瘤治疗提供新的基因靶点。

［1］ WatsonAJ.Apoptosisandcolorectalcancer[J].Gut,2004,53(11):1701

［2］ Yu J,Zhang L,Hwang PM,et al.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cell[J].Mol Cell,2001,7(3)：673

［3］ 张克君，李德春，朱东明.PUMA蛋白在胰腺癌中的表达及临床意义[J].世界华人消化杂志,2008,16(5):488

［4］ Garrison SP,Jeffers JR,Yang C,et al.Selection against PUMA gene expression in Myc-driven B-cell lymphomagenesis[J].Mol Cell Biol,2008，28(17)：5391

［5］ 梁素美，文欣轩，方细堂.结直肠癌中survivin、caspase-3、p21WAF1的蛋白表达及其意义[J].肿瘤防治研究，2007，34(8)：596

［6］ Sinicrope FA,Rego RL,Okumura K,et al.Prognostic impact of Bim,Puma,and Noxa expression in human colon carcinomas[J]. Clin Cancer Res，2008，14(18):5810

［7］ Yu J,Zhang L.PUMA,a potent killer with or without p53[J]. Oncogene,2008,27（1）:71

［8］ Karst AM,Dai DL,Martinka M,et al.PUMA expression is significantly reduced in human cutaneous melanomas[J].Oncogene,2005, 24(6):1111

［9］ 陈鑫，张尤历，乌慧玲，等.PUMA基因在胃癌组织及细胞中的表达[J].世界华人消化杂志，2010，18（12）：1227

［10］Jansson A,Arbman G,Sun XF,et al.mRNA and protein expression of PUMA in sporadic colorectal cancer[J].Oncol Rep,2004,12(6): 1245

［11］Yu J.PUMA kills stem cells to stall cancer[J].Mol Cell Pharmacol, 2009,1(3):112

［12］Qiu W,Carson-Walter EB,Kuan SF，et al.PUMA suppresses intestinal tumorigenesis in mice[J].Cancer Res,2009,69(12):499

［13］Chen JC,Lu KW,Lee JH,et al.Gypenosides induced apoptosis in human colon cancer cells through the mitochondria-dependent pathways and activation of caspase-3[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2009,12(4):391

［14］Sun BH,Zhang J,Wang BJ,et al.Analysis of in vivo patterns of caspase-3gene expression in primary hepatocelluar carcinoma and its relationship to p21(WAF1)expression and hepatic apoptosis [J].World J Gastroenterol,2000,6(3):356

［15］Hsia JY,Chen CY,Chen JT,et al.Prognostic significance of Caspase-3expression in primary resected esophageal squamous cell carcinoma[J].Eur J Surg Oncol,2003,29(1):44

［16］GuanJT,WangL,WangY,etal.ExpressionofAIFandcaspase-3in colorectal carcinoma,adenoma,and normal mucosa and its correlation[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2009,12(4):391

［17］Jonges LE,Nagelkerke JF,Ensink NG,et al.Caspase-3activity as a prognostic factor in colorectal carcinoma[J].Lab Lnvest,2001,81(15):681

［18］Letai A.Puma strikes Bax[J].Cell Biol,2009,185(2):189