小鼠Dishevelled 2表达质粒的构建及其在RAW 264.7细胞中的表达

黄旭 赵鹃 毛英杰 谷志远

（1.浙江大学医学院附属第一医院 口腔科，杭州 310003；

2.浙江大学医学院附属口腔医院 修复科；3.颌面外科，杭州 310006）

小鼠Dishevelled 2表达质粒的构建及其在RAW 264.7细胞中的表达

黄旭1赵鹃2毛英杰3谷志远3

（1.浙江大学医学院附属第一医院 口腔科，杭州 310003；

2.浙江大学医学院附属口腔医院 修复科；3.颌面外科，杭州 310006）

目的 构建小鼠Dishevelled 2（Dvl2）表达质粒，并检测其转染小鼠破骨前体细胞RAW264.7后的表达，为进一步研究Dvl2在破骨细胞分化和骨重建中的作用、筛选调节骨重建潜在靶点奠定基础。方法 根据GenBank小鼠Dvl2 cDNA序列设计两条特异性引物，提取RAW264.7细胞总RNA，以RT-PCR获得Dvl2的开放阅读框（ORF），并将其克隆到真核表达质粒pEZ-M29上，酶切电泳，测序鉴定构建的pEZ-M29/Dvl2质粒。用脂质体介导瞬时转染RAW 264.7细胞，通过荧光显微镜观察转染效果，实时定量RT-PCR检测Dvl2基因表达情况。结果 成功构建pEZ-M29/Dvl2表达载体，酶切电泳和测序结果与目的基因相符；转染RAW264.7细胞后48 h，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达；实时定量RT-PCR可见实验组Dvl2基因较对照组强烈过表达。结论 成功构建小鼠Dvl2真核表达质粒pEZ-M29/Dvl2，瞬时转染小鼠破骨前体细胞RAW264.7可显著提高Dvl2的mRNA水平。

Dishevelled 2； 表达质粒； RAW264.7细胞； 破骨细胞

骨重建参与口腔医学的各个方面，如正畸牙的移动、种植体骨整合界面的形成、牙列缺失后牙槽骨的吸收等。研究骨重建的机理，选择适宜的靶点，一直是口腔医学研究及临床的热点。骨重建中，破骨细胞和成骨细胞不可或缺。破骨细胞功能的过度抑制或破骨细胞缺乏都会影响成骨细胞的骨形成[1-3]。而恢复破骨细胞的功能，则有助于形成正常的骨组织结构[4-5]。破骨细胞和成骨细胞间存在着双向ephrinB2/EphB4膜分子信号耦联，当成熟破骨细胞表面的ephrinB2和成骨前体细胞表面的EphB4相接触时，信号同时、双向传入成骨细胞（正向）和破骨细胞（逆向），正向信号激活成骨细胞的分化，而逆向信号抑制破骨细胞的分化[6-7]。这项研究结果很好的解释了骨重建转换阶段中，破骨细胞骨吸收停止、活性消失，同时成骨细胞分化、活化，这一关键现象[6]。这一发现也从信号传导机制解释了采用抑制骨吸收的传统治疗方法有时不能促进骨形成的失败原因，提示了利用破骨细胞促进成骨细胞分化的信号耦联以治疗骨疾病、促进骨整合的新思路以及新靶点，其中，破骨细胞逆向信号传导下游通路中与ephrinB2作用的结构域蛋白质是潜在的作用靶点[6]。本课题组的最新研究结果，从破骨细胞内表达的多种结构域蛋白质中，筛选出Dishevelled 2（Dvl2）与ephrinB2固有结合，它极可能是参与ephrin-B2/EphB4逆向信号转导的PDZ结构域蛋白质[8]。但尚需采用实验证实Dvl2在破骨细胞分化中的功能。

本实验根据Dvl2编码区的序列，构建了含CMV启动子和绿色荧光标记蛋白的表达质粒pEZ-M29/ Dvl2，通过脂质体将其瞬时转染破骨前体细胞RAW 264.7，通过实时定量PCR的方法鉴定过表达Dvl2的RAW264.7细胞，为深入研究Dvl2在破骨细胞分化中的作用及其在破骨细胞/成骨细胞ephrinB2/EphB4信号耦联中的作用机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

pEZ-M29质粒载体（广州复能基因有限公司），Taq酶、dNTP、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DL 2000 DNA Marker、DH5α感受态细胞、PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBRRPremix Ex TaqTMKit（Takara公司，日本）；T4 DNA ligase（Fermentas公司，立陶宛）；SrfⅠ、Eco RⅠ（NEB公司，美国）；250bp DNA ladder plus和鉴定质粒的PCR引物（上海生工生物工程公司）；Annealing Buffer for DNA Oligos（5×）（碧云天公司）；0.25%Trypsin＆0.02%EDTA（吉诺生物医药技术有限公司）；Hyclone磷酸盐缓冲液（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；转染试剂Lipofectamine 2000、RNA抽提试剂TRIZOL（Invitrogen公司，美国）；质粒提取试剂盒（Axygen公司，美国）；α-MEM培养液和DMEM高糖培养液（Gibco公司，美国）；RAW264.7细胞（ATCC TIB-71）。

1.2 Dvl2基因克隆

按TRIZOL试剂说明书操作提取RAW264.7细胞总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录cDNA。从GenBank查询鼠Dishevelled 2（NM_007888），dsh homolog（Drosophila）的开放阅读框（open read length，ORF）序列，并设计带酶切位点的PCR引物，设计引物如下：F：GAATTCGGTACCATGGCGGG（下划线标记Eco RⅠ酶切位点）；R：GCCCGGGCTCTTCTACATAA（下划线标记SrfⅠ酶切位点）。从cDNA中，用RT-PCR反应合成带酶切位点的Dvl2 ORF片段，PCR产物在1.5%的琼脂糖胶上100 V，30min检测条带。

1.3 酶切

取1μg的pEZ-M29质粒和PCR目的产物，用Eco RⅠ和SrfⅠ37℃双酶切2 h，1.5%胶电泳，割胶回收大片段的质粒和PCR产物，检测浓度。

1.4 连接反应

在T4 DNA连接酶作用下，PCR产物和质粒回收片段以10∶1的量进行连接反应，16℃连接1 h。

1.5 转化

取1支DH5α感受态细胞（每管100μL，-80℃保存）于冰上，待溶解后加入10μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90 s。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3min。每管加900μL LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1 h使细菌复苏。取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上。倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养16 h。

1.6 阳性克隆筛选及鉴定

挑取平板上长出的单菌落，重悬于10μL LB培养液中，从中取1μL做模板进行菌落PCR鉴定。提取质粒，进行酶切和测序鉴定，DNA测序由美国加州浙江大学纳米研究院进行。测序引物：Forward：5’-CCGACAACCACTACCTGA-3’，Reverse：5’-GTGGCACCTTCCAGGGTC-3’。测序正确的，再接种抽提质粒。

1.7 脂质体介导pEZ-M29/Dvl2转染破骨前体细胞RAW264.7

取第3代RAW264.7细胞，进行转染实验。转染前以每孔4.5×105个细胞将RAW264.7细胞接种于6孔板内，置于37℃5%CO2的培养箱中培养，当细胞融合度达90%时，按照Lipofectamine2000的说明书进行过表达载体质粒和空载体质粒的转染。简要过程如下：转染前1～2 h换液，弃掉培养基，加入2mL新鲜完全培养基；将4μg质粒加入到250μL不含血清的opti-MEM培养基中，轻柔混匀制成混合物A备用；将10μL Lipofectamine 2000加入到250μL不含血清的opti-MEM培养基中，轻柔混匀制成混合物B，室温下放置5min；将A和B轻柔混匀，室温下静置20min后，将混合液加入到接种细胞的孔中，轻轻摇匀，置于37℃5%CO2培养箱中培养（未转染组细胞中加入不含血清的opti-MEM培养基）；4～6 h后换成含双抗的完全培养基，置于37℃5%CO2培养箱中继续培养；培养48 h后荧光显微镜下拍照，观察细胞转染情况。同时收集各组细胞，离心沉淀后用于实时定量RT-PCR。

1.8 实时定量RT-PCR测定Dvl2基因的表达变化

收集各组细胞，以TRIZOL试剂提取RAW264.7细胞总RNA，将提取的总RNA用Rnase free的去离子水溶解，-80℃保存。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录cDNA，操作方法同前。采用SYBRRPremix Ex TaqTMKit试剂盒进行实时定量RT-PCR。PCR反应条件：95℃预变性4min，95℃变性30 s，60℃复性30 s，72℃延伸60 s，循环40次，然后72℃温育10min。以Beta-actin作为内参。引物均由Takara公司设计合成。Dishevelled 2 sense：5’-GCAGTGTCACCGATTCCACAA-3’；antisense：5’-CTTTCATGATGGAGCCGATGTAGA-3’；Beta-actin sense：5’-AGGAGCAATGATCTTGATCTT-3’；antisense：5’-TGCCAACACAGTGCTGTCT-3’。独立重复实验3次，用2-ΔΔCt方法分析所得数据，以比较各组的基因表达。

2 结果

2.1 重组质粒构建

重组质粒pEZ-M29/Dvl2中Dvl2的ORF长度为2 211 bp，载体长度6 131 bp，经Eco RⅠ和SrfⅠ双酶切后，凝胶电泳显示出相应大小的目的基因片段和载体片段；测序结果显示，重组质粒中目的基因编码序列结果与GenBank中Dvl2序列一致。

2.2 重组质粒转染RAW264.7细胞的鉴定

脂质体转染48h后，荧光显微镜下观察（图1），可见部分细胞表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），代表转染成功。

2.3 重组质粒转染的RAW264.7细胞的Dvl2 mRNA表达

转染48 h后，即可检测到重组质粒转染组较空质粒转染组Dvl2 mRNA表达水平提高27.5倍（图2）。

图1 重组质粒pEZ-M29/Dvl2转染RAW264.7细胞的形态 荧光显微镜 ×40Fig 1 Images of pEZ-M29/Dvl2-transfected RAW 264.7 cells fluorescence microscope ×40

图2 实时定量RT-PCR测定Dvl2在RAW264.7细胞中的表达Fig 2 Dvl2 mRNA levels of RAW264.7 cells by real-time RTPCR

3 讨论

为了进一步研究Dvl2蛋白在破骨细胞分化及功能过程中的作用，本文应用基因工程技术及分子生物学的方法，根据GenBank上公布的小鼠Dvl2 cDNA序列设计2条特异性引物，从小鼠RAW264.7细胞株中提取总RNA，以RT-PCR反应获得编码Dvl2蛋白的ORF读框，并将其克隆到真核表达质粒pEZ-M29上，瞬时转染RAW264.7细胞，荧光显微镜观察显示转染成功，实时定量RT-PCR测定Dvl2基因的表达显著提高，为建立稳定转染破骨前体细胞系打下基础。

本实验根据Dvl2及载体质粒基因结构特点，构建Dvl2基因真核表达质粒。pEZ-M29质粒是6 131 bp大小的质粒，具有以下几方面特点：1）自身携带能发出绿色荧光的EGFP报告基因，在荧光显微镜下，即可观察到绿色荧光，无需任何作用底物或共作用物，直接、简捷、便于检测，检测的灵敏度高；EGFP绿色荧光蛋白本身性质稳定，可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；EGFP绿色荧光蛋白基因片段长度较小（约717 bp），易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。2）含有高效的功能强大的CMV启动子，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。3）具有多克隆位点，便于目的基因的插入。4）该载体具有Ampicillin基因，可以采用氨苄霉素来筛选已成功转染了该载体的菌株。5）该载体具有Neomycin基因，可以采用G418药物压力筛选稳定转染了该载体的破骨前体细胞，以便用于Dvl2过表达破骨前体细胞的传代及破骨细胞分化功能研究。

Dvl是一种胞浆蛋白，分为Dvl1、Dvl2和Dvl3，均含有3个保守的蛋白结构域：DIX（Dishevelled-Axin）结构域，PDZ（postsynaptic density protein PSD-95，discslarge，and ZO-1）结构域和DEP（Dsh,Egl10，Pleckstrin）结构域[9]。Dvl2众所周知的生物学功能是作为Wnt信号通路的关键中间传导分子，参与了上游信号在胞膜、胞浆以及胞核的一系列传导[10]。Dvl2位于Frizzled/LRP6/G-protein下游、GSK3上游，主要参与3条Wnt信号通路：PDE6-cGMP-Ca2+通路，planar cell polarity/convergent extension（PCP/CE）通路和Wnt/ β-catenin经典通路[9-10]。

Wnt信号通路广泛参与了各种骨组织活动，包括胚胎骨骼成型、胎儿骨骼发育以及成年骨重建[11-12]。Wnt/β-catenin信号通路可以通过多种机制促进骨形成从而影响骨量，其中，Dvl2作为Wnt信号通路的关键分子，在老年人骨中mRNA水平的降低反映出Wnt信号通路的减弱，由此造成骨量的减少；但是在骨关节炎患者中，Dvl2 mRNA表达水平反而升高[13-14]。目前，大多数研究都是针对成骨细胞中Wnt通路及Dvl2对其分化的促进作用以及对破骨细胞分化的间接促进作用，例如，有文献报道，Wnt对成骨细胞的作用受细胞分化程度的影响，即Wnt可以刺激早期成骨细胞的分化，但是抑制成熟成骨细胞的矿化能力，另外，成骨细胞的分化抑制内源性Wnt信号传导，并且影响多种Wnt信号通路相关基因的表达[15]。再如，成骨细胞中，甲状旁腺激素受体（parathyroid hormone receptor，PTHR）通过直接结合Dvl2激活β-catenin及其下游通路（不通过Wnt），直接促进成骨细胞分化，并间接促进破骨细胞分化[16]。但是，鲜有破骨细胞中Dvl2表达及直接参与破骨细胞分化及功能的研究报道。

ephrinB2/EphB4是最新报道的骨重建转化阶段的重要信号耦联[6-7]，本课题组的最新研究进展提示破骨细胞内Dvl2与ephrinB2固有结合，它极可能是参与ephrinB2/EphB4逆向信号转导的PDZ结构域蛋白质[8]。生物化学方面的研究表明，Dvl2可以与EphB受体或ephrinB配体固有结合为复合体，受上游分子刺激后，与EphB或ephrinB分离，作为其下游分子传递信号[17]。在视网膜前体细胞、神经干细胞等细胞中，ephrinB可经由Dvl2介导的PCP/CE通路及其下游的Rho GTPase通路或c-Jnk通路产生一系列生物活动，特别是细胞骨架蛋白的改变和细胞移动[18]。众所周知，活化破骨细胞的细胞骨架改变和细胞移动对其功能活动非常重要。但是在破骨细胞中，ephrinB2/EphB4与Dvl2之间的结合是否具有生物学意义，它们的结合是否具有与其在视网膜前体细胞和神经干细胞中相似的功能作用，即是否影响细胞骨架中F-actin蛋白及细胞移动，尚需进一步研究。

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（本文编辑 汤亚玲）

Construction of vectors encoding mouse Dishevelled 2 and its expression in RAW 264.7 cells

HUANG Xu1,ZHAO Juan2,MAO Ying-jie3,GU Zhi-yuan3.（1.Dept.of Stomatology,The First Affiliated Hospital of Medical College of Zhejiang University,Hangzhou310003,China;2.Dept.of Prosthodontics,The Affiliated Hospital of Stomatology,Medical College of Zhejiang University,Hangzhou310006,China;3.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The Affiliated Hospital of Stomatology,Medical College of Zhejiang University,Hangzhou310006,China）

ObjectiveTo construct the recombinant vectors that express mouse Dishevelled 2（Dvl2）,and to evaluate its expression level in transfected RAW264.7 cells.MethodsA pair of specific primers were designed according to the mouse Dvl2 cDNA sequence published in GenBank.Total RNA of RAW264.7 cells was extracted,and open reading frame of Dvl2 was obtained by RT-PCR,which was then cloned into pEZ-M29 plasmid.Electrophoresis after macrorestriction and DNA sequence analysis were used to identify the reconstructed plasmids.After transient transfection via liposome,the transfection of RAW264.7 cells was confirmed under a fluorescence microscope,and the expression level of Dvl2 was evaluated by real-time RT-PCR.Results The recombinant plasmid containing mouse Dvl2,namely pEZ-M29/ Dvl2,was successfully constructed,and confirmed by DNA sequence analysis.After 48 h of tranfection,the expression of enhanced green fluorescene protein was observed under a fluorescence microscope,and real-time RT-PCR analysis revealed that the Dvl2 mRNA level was prominantly elevated in the transient transfected RAW264.7 cells.ConclusionThe recombinant plasmids pEZ-M29/Dvl2 are successfully constructed and can elevate the Dvl2 mRNA level in the transient transfected RAW264.7 cells,which can be used in further studies aiming at revealing the functional significance of Dvl2 in the osteoclastogenesis.

Dishevelled 2； expression plasmid； RAW264.7 cells； osteoclasts

R 782.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.022

1000－1182（2011）03－0306-04

2010-12-17；

2011-03-10

国家自然科学基金资助项目（30700958）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2100333）

黄旭（1977—），男，浙江人，主治医师，硕士

赵鹃，Tel：0571-87217225