细胞周期素D1在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

邢劲松 史培荣 陈显久 何东宁 李丽华 南欣荣

（1.山西医科大学第二医院 口腔科；2.山西医科大学口腔医学系 口腔颌面外科教研室，太原 030001）

细胞周期素D1在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

邢劲松1史培荣2陈显久2何东宁2李丽华2南欣荣2

（1.山西医科大学第二医院 口腔科；2.山西医科大学口腔医学系 口腔颌面外科教研室，太原 030001）

目的 研究口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织中细胞周期素D1（Cyclin D1）的表达及意义。方法 应用免疫组织化学Envosion法检测50例OSCC患者与10例正常黏膜组织中Cyclin D1蛋白在病理组织切片中的表达水平，并进行统计学分析。结果 在50例OSCC标本中Cyclin D1主要表达在细胞核，也有少量表达在细胞浆。Cyclin D1在OSCC标本中的阳性表达率80.0%，明显高于在正常口腔黏膜组织中的表达率20.0%，差异有统计学意义（P<0.01）。Cyclin D1表达与OSCC病理分级、临床分期和是否有淋巴结转移密切相关（P<0.05）。结论 Cyclin D1蛋白的异常表达与OSCC的发生、发展有密切的关系，可作为OSCC治疗和预后的辅助性指标。

口腔鳞状细胞癌； 细胞周期素D1； 免疫组织化学

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）在口腔颌面部恶性肿瘤中最为常见，其发生与抑癌基因的表达有密切的关系。近年来的研究表明：抑癌基因参与细胞的信号传导系统，在正常情况下对DNA的复制、细胞的生长和增殖起着监控作用，它们在基因水平上的突变和因此导致其编码蛋白质功能的丧失是肿瘤细胞生长失控的重要原因。在细胞周期调控中，细胞周期素D1（Cyclin D1）是细胞周期中G1期进入S期的重要调控因子，G1→S期间调控点是细胞内外信号传递，整合汇集到细胞核，对细胞的增殖进行调控的关键点，该点调控的异常与肿瘤的发生发展关系密切。关于Cyclin D1蛋白在口腔鳞癌组织中表达的临床意义国内外尚未见报道。本实验采用免疫组织化学Envosion法对Cyclin D1蛋白在口腔鳞癌组织的表达进行了检测，探讨其与口腔鳞癌发生发展的关系，并分析其与口腔鳞癌临床病理参数的关系，以探讨Cyclin D1在口腔鳞癌癌变过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 标本来源

OSCC标本取自山西医科大学第一医院病理科2005年1月—2009年12月存档蜡块，共50例，其中唇癌10例，舌癌12例，颊癌10例，牙龈癌10例，口底癌8例；男性35例，女性15例；年龄最大76岁，最小20岁，平均年龄49.5岁；高分化鳞癌18例，中分化鳞癌15例，低分化鳞癌17例。按照国际抗癌联盟（UICC）2002年TNM分类及分期标准对50例口腔鳞状细胞癌标本进行TNM分类和临床分期，其中T1期7例，T2期15例，T3期15例，T4期13例；伴颈淋巴结转移20例。选取10例正常口腔黏膜组织做为对照，其中男性6例，女性4例，平均年龄42.5岁。实验组病例纳入标准为：要求均为首次治疗病例；2位病理科专家检查共同证实确为OSCC病例；有完整记录。实验组病历排除标准为：复发后入院病例；术前接受过放化疗治疗的OSCC病例。

1.2 主要试剂

一抗兔抗人Cyclin D1单克隆抗体，由福州迈新生物技术开发有限公司提供；二抗PV-6000由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 实验方法

标本切片，厚度为3～5μm，应用免疫组织化学试剂盒（Envision PV-6000 PowerVisionTM）二步法进行染色。所有标本常规脱蜡、脱水，PBS洗涤3次，每次2min。Cyclin D1抗体采用高压锅热修复15min，自然冷却20～30min，PBS洗涤2min3次，每次2min。滴加兔抗人Cyclin D1单克隆抗体（工作浓度为1∶25），4℃冰箱过夜。室温下放置15～20min后PBS洗涤3次，每次2min。滴加二抗PV-6000，37℃孵育20 min后温室继续孵育10min，PBS洗涤3次，每次2min；DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。已知阳性的OSCC组织标本作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。免疫组织化学染色以细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片随机选取10个高倍视野（×400），记录1 000个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞数。根据每一切片的染色细胞比例及染色强度分为4种：阴性（-）为未见棕黄色颗粒；弱阳性（+）为阳性细胞数＜25%；中度阳性（++）为阳性细胞数25%～75%；强阳性（+++）为阳性细胞数＞75%。

1.4 统计学分析

所得数据结果使用SPSS13.0统计学软件，采用χ2检验、确切概率法（Fisher法）及Spearman秩相关统计学方法进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在50例OSCC组织中Cyclin D1主要表达在细胞核，也有少量表达在细胞浆，结果见图1。

图1 Cyclin D1在OSCC组织中的表达 Envision ×250Fig 1 Cyclin D1 expression in OSCC tissue Envision ×250

在OSCC组织中的表达率为80.0%，明显高于在正常口腔黏膜组织中的表达率20.0%（P<0.01），说明Cyclin D1参与了口腔鳞状细胞癌的发生和发展。随着OSCC恶性程度的增加，Cyclin D1表达随之增高：高分化OSCC组织有38.9%的表达，中分化OSCC组织有66.7%的表达，低分化OSCC组织有88.2%的表达，差异有显著性（P<0.01）；低分化OSCC组织Cyclin D1表达率显著高于高分化组织（P<0.05），说明Cyclin D1阳性表达与OSCC组织分化程度有关。临床T1期OSCC组织Cyclin D1阳性表达率为42.9%，临床T2期OSCC阳性表达率为66.7%，临床T3期OSCC阳性表达率为86.7%，临床T4期OSCC阳性表达率为92.3%，差异有显著性（P<0.05）；同时，T4期Cyclin D1的表达显著高于T1期（P<0.05）。有淋巴结转移的OSCC组织中Cyclin D1蛋白表达水平明显高于无淋巴结转移者（P< 0.01）。上述结果提示：OSCC的发生与细胞周期有关，Cyclin D1阳性表达与OSCC组织分化程度、临床分期、是否有淋巴结转移密切相关，间接说明Cyclin D1的阳性表达与OSCC患者的愈后可能有关（表1）。

表1 Cyclin D1在OSCC组织中的表达Tab 1 Cyclin D1 expression in OSCC tissue

3 讨论

肿瘤的发生是一个多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程。OSCC是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，约占口腔颌面部恶性肿瘤的80%，其发病因素与烟酒等不良嗜好、环境污染、机械刺激及生物学因素等有关，并涉及多个基因的改变[1]。

报道显示：Cyclin D1基因定位于染色体11q13[2]，长约120 kb，基因跨距约15 kb，含有5个外显子，编码295个氨基酸构成的蛋白质，相对分子质量为34 000[3]，是与细胞周期中G1期调控有关的蛋白，被认为是癌基因[4]，在细胞周期进程中，其含量受到生长因子等因素的调控，呈周期性变化。细胞周期向前发展是在细胞周期调控因子，即细胞周期蛋白家族和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）形成复合物后共同作用引起的[5-6]。Cyclin D1是细胞周期蛋白家族中的重要一员，它与相应的CDK4或CDK6结合，形成Cyclin 2/CDK复合物，激活Rb蛋白，启动细胞S期相关基因的转录，使细胞进入自主分裂增殖程序。导致CDK激酶活化，使细胞分裂由G1期进入S期[7]。当Cyclin D1扩增或过表达时，G1/S期缩短，促使细胞增殖，导致癌变。Cyclin D1的一个重要特点是其蛋白的过量表达与肿瘤的浸润转移有关。本研究结果显示：正常口腔黏膜组织中Cyclin D1蛋白有少量表达，在OSCC组织中表达明显升高，提示Cyclin D1蛋白的表达发生在OSCC恶性转化的早期，与OSCC的发生有关。

随着对Cyclin D1研究的不断深入，人们发现Cyclin D1不但与肿瘤的发生发展相关，而且与肿瘤的转移、预后也密切相关。Hameed等[8]利用免疫组织化学发现：发生转移的乳头状甲状腺癌患者中90.9% Cyclin D1蛋白过表达，而未发生转移的患者中Cyclin D1蛋白过表达者仅为8.8%。在多种肿瘤中均发现Cyclin D1蛋白过表达者的生存率明显低于低表达者，提示其可作为有效预后因子[9-10]。本研究结果显示：淋巴结转移组Cyclin D1蛋白阳性表达率明显高于无淋巴转移组（P<0.05）；Ⅲ和Ⅳ期癌组织Cyclin D1蛋白阳性表达率高于Ⅰ和Ⅱ期（P<0.05）。提示Cyclin D1蛋白不但参与原位肿瘤形成过程的调节，促进其发展，可能还参与癌细胞转移过程的调节，在转移过程中发挥作用，可能是影响OSCC预后的重要分子生物学指标。

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（本文编辑 汤亚玲）

Expression and its significance of Cyclin D1 in oral squamous cell carcinoma

XING Jin-song1,SHI Pei-rong2,CHEN Xian-jiu2,HE Dong-ning2,LI Li-hua2,NAN Xin-rong2.（1.Dept.of Stomatology,The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China;2.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,Dental Medical Department of Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Cyclin D1 in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsA immunohistochemistry method,Envosion,was employed to test the manifesting levels of Cyclin D1 in pathological slices of 50 OSCC cases and 10 normal cases,and the results was treated with statistical analysis.Results In 50 OSCC cases,Cyclin D1 mainly manifested in karyon,and a little in cytoplasm.The positive manifesting rates of Cyclin D1 in the samples was 80.0%,which was significantly higher than the manifesting rates of 20.0%in normal oral mucous membrane（P<0.01）.The manifestation of Cyclin D1 was correlated with the different pathological grades,clinical phases and lymph node metastasis（P<0.05）.ConclusionThe abnormal manifestation of Cyclin D1 is closely related with the occurrence and development of OSCC.Therefore,it can be used as subsidiary index for OSCC treatment and prognosis.

oral squamous cell carcinoma； Cyclin D1； immunohistochemistry

R 782.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.020

1000－1182（2011）03－0299-03

2010-09-09；

2010-12-10

山西省科技工业攻关基金资助项目（20090322028-1）

邢劲松（1974—），男，山西人，主治医师，硕士

南欣荣，Tel：13903434186