鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株与拓扑异构酶IV关系研究

刘芳萍，李昌文，刘立新，李 睿，罗鹏志，卢斯亮，张秀英

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030； 2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150001）

鸡沙门氏菌病是危害我国养禽业健康发展的重要疾病之一，在雏鸡中具有较高的发病率和死亡率，成年鸡则严重影响其生产性能。目前主要使用抗菌药物对该病进行预防和治疗。氟喹诺酮类药物为一类化学合成的广谱、高效、低毒的抗菌药物。随着该类药物的长期应用及不当使用，鸡沙门氏菌对其耐药性也随之广泛产生，且耐药率呈逐年升高的趋势[1-3]。耐药性的产生导致预防和治疗的失败，给养禽业带来巨大的经济损失。而且，耐药性可通过食物链传递给人群，也严重危害着人类的健康。

研究表明，沙门氏菌对氟喹诺酮类产生耐药的原因与氟喹诺酮类药物作用的靶位-DNA旋转酶（由gyrA和gyrB基因编码）和拓扑异构酶Ⅳ（由parC和parE基因编码）发生改变有一定的相关性。DNA旋转酶和拓扑异构酶IV各亚基上都有一与喹诺酮类药物耐药性产生有关的保守区域，称为喹诺酮类药物耐药决定区（Quinolone resistance-determining region，QRDR），此区域内的基因突变导致相应氨基酸变异是引起喹诺酮类药物耐药的关键因素[4-5]。关于DNA旋转酶与氟喹诺酮类药物耐药性的关系已有另文详述[6]。本文针对临床分离的9株对5种氟喹诺酮类药物（环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星）耐药水平较高的鸡源性沙门氏菌拓扑异构酶IV进行研究，分析耐药基因突变与耐药性产生的关系，探讨鸡源性沙门氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制，为进一步研究沙门氏菌的耐药机制打下了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

质控菌株:雏鸡沙门氏菌NCTC5776，购自中国药品生物制品检定所。

试验菌株:鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株37、38、42、55、60、61、68、217和251，由齐齐哈尔、吉林、双城等地的病鸡粪便样本分离所得。

1.2 药品与试剂

pMD18-T载体、Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Eco RⅠ和HindⅢ、蛋白酶K、反转录酶、DNAmarker DL2000等均购自TaKaRa公司；DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.3 引物设计

图1 parC基因片段PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification product of parC gene

根据GenBank中鼠伤寒沙门氏菌LT2全基因序列，上游引物parCF:5′TAA TGA GCG ATA TGG CAG AG 3′，下游引物 parCR:5′GGT AAC ATT TTC GGT TCC TG 3′，引物位于parC基因序列的14～469bp；上游引物 parEF:5′TAA TCG GAC CGA GCT GTT CC 3′，下游引物 parER:5′TGC ATC GGG TTC ATT TCT CC 3′，引物位于parE基因序列的1227～1699bp处。扩增的区域涵盖了氟喹诺酮类药物耐药性决定区（QRDR）。

1.4 parC基因和parE基因的扩增

PCR体系25μL:染色体DNA 1.0μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2.5μL，dNTPs Mixture（各 2.5 mmol·L-1）2.0μL，上下游引物（10 pmol·μL-1）各0.5μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2μL。parC 基因的PCR反应参数为:95℃热启动10 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃温育10 min。parE基因的PCR反应参数为:95℃热启动10 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃温育10 min。

1.5 PCR产物的克隆及序列分析

PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后，克隆到pMD18-T载体上。提取质粒，用Eco RⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定。

由上海联合基因科技有限公司测序，测得的核苷酸序列用DNASIS和DNAmaN软件分析。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌parC基因和parE基因片段扩增结果

扩增parC基因片段大小为475bp，扩增parE基因片段大小为492bp。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1、2，在500～750bp处出现特异的目的片段，与预计的片段大小基本一致。

图2 parE基因片段PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification product of parE gene

2.2 parC基因测序结果及分析

临床分离鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药菌株与质控菌株和GenBank数据库登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2株parC基因片段核苷酸序列比较见表1。

9株临床分离耐药株与质控菌株和LT2株的parC基因QRDR的核苷酸及氨基酸序列完全相同。

2.3 parE基因测序结果及分析

临床分离鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药菌株与质控菌株和GenBank数据库登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2株parE基因片段核苷酸序列比较见表2。

表1 10株鸡源沙门氏菌parC基因核苷酸序列与鼠伤寒沙门氏菌LT2株比较Table1 Nucletide sequence comparing of parC genes between ten chicken origins and Salmonella typhimurium LT2

表2 10株鸡源沙门氏菌parE基因核苷酸序列与鼠伤寒沙门氏菌LT2株比较Table2 Nucletide sequence comparing of parE genes between ten chicken origins and Salmonella typhimurium LT2

质控菌株与GenBank数据库登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2的parE基因QRDR的核苷酸序列有几处不同，包括C-1341→T、G-1347→A、A-1380→G、C-1527→T、A-1569→G。与质控菌株相比，9株临床分离得到的鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株中菌株37、55和60的parE基因QRDR发生单碱基突变，包括菌株37的T-1434→C、菌株55的T-1434→C和菌株60的T-1517→C，此外菌株55的parE基因第1341位为C、第1380位为A，与NCTC5776不同，但与LT2相同。

利用DNAmaN软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，与GenBank数据库登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2的氨基酸序列进行比较分析。质控菌株与LT2的parE基因的QRDR的氨基酸序列完全相同；与质控菌株相比，9株临床分离耐药株中只有60的parE基因第506位氨基酸发生F→S（Phe→Ser）取代，且位于QRDR内，其余菌株的氨基酸均未发生变化。

3 讨论与结论

氟喹诺酮类药物作用于革兰氏阴性菌的首选靶位是DNA旋转酶（gyrA、gyrB基因），革兰氏阳性菌的首选靶位是拓扑异构酶IV（parC、parE基因，金黄色葡萄球菌是grlA、grlB基因）。酶的作用机制是大肠杆菌、金葡球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌和支原体等病原微生物对氟喹诺酮类药物产生耐药性的重要机制。

Guerra等从牛体内分离得到的对萘啶酸和环丙沙星耐药的沙门氏菌中，有一株parC基因发生了Ser80→Ile取代[7]。Baucheron等报道缺失parC基因Ser80→Ile改变能使耐药鼠伤寒沙门氏菌DT204对氟喹诺酮类的敏感性增加16～32倍[8]。魏秀丽等对沙门氏菌DNA旋转酶在氟哇诺酮类药物作用压力下发生突变进行分析发现[9]，在gyrA基因83和87位双位点突变的基础上，parC基因在80位还发生Ser被Arg或lIe代替，加重耐药性的增长，因此parC基因可能也是氟哇诺酮类药物的作用位点。Reche等试验了7株对萘啶酸高度耐药的沙门氏菌，所有菌株的parC基因未发生任何突变，因而得出parC基因突变对于获得高水平萘啶酸耐药株是不必要的[10]。Luke等的研究也没有发现突变仅出现在parC基因这一现象[11]。本试验中质控菌株和9株临床分离株与GenBank数据库登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2株parC基因QRDR的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为100%。这表明，parC基因在沙门氏菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性中并不占主导地位。

本试验中质控菌株与LT2的parE基因QRDR的氨基酸序列同源性为100%，9株临床分离鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株中只有菌株60的parE基因第506位氨基酸发生F→S（Phe→Ser）取代，位于QRDR区域内，与质控菌株parE基因QRDR的氨基酸的同源性为99.4%，其余菌株与质控菌株parE基因QRDR的氨基酸的同源性均为100%。关于氟喹诺酮类耐药沙门氏菌parE基因发生突变未见报道。Giraud等用恩诺沙星通过体外和体内诱导产生沙门氏菌耐药株来分析耐药性产生的分子机制，分析结果没有发现gyrB、parC、parE基因的突变。Hirose等对从1995年到2001年从病人血液或分泌物中分离得到的氟喹诺酮类耐药肠炎沙门氏菌的gyrA、gyrB、parC、parE基因进行研究，发现所有菌株的gyrB和parE基因均未发生突变[12]。Piddock对人源性和可食动物源性氟喹诺酮类耐药肠炎沙门氏菌进行研究，没有发现parC、parE基因的突变位点[13]。本研究中发现的菌株60的parE基因QRDR第506位氨基酸的变异与耐药水平之间的关系还有待进一步试验研究。

本研究克隆了parC和parE基因的QRDR，序列分析结果表明，所有耐药株的parC基因均未发生任何氨基酸改变，只有菌株60的parE基因发生Phe506→Ser氨基酸取代。本次研究表明，parE基因突变与耐药性虽有一定的关系，但拓扑异构酶Ⅳ的作用机制可能并不是沙门氏菌对氟喹诺酮类耐药的主要机制，沙门氏菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性，还存在其他的耐药机制。

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