同病异证H22肿瘤小鼠内分泌-免疫网络的物质基础*

2011-03-01方肇勤潘志强卢文丽吴中华管冬元张园园王艳明丁善萍

中国中医基础医学杂志 2011年7期

方肇勤，潘志强，卢文丽，吴中华，管冬元，梁超，张园园，王艳明，丁善萍，颜彦

肝癌是我国的重大疾病、难治病，疗效提高缓慢［1］，因而探索和提高肝癌的疗效是一项长期而艰巨的任务。中医药在我国肝癌防治中发挥着重要的作用，在改善患者生存质量，延长带瘤生存期等方面具有一定的优势。中医药防治肝癌的特点是辨证论治，即依据“同病异证”实施“同病异治”。因此，揭示同病异证的发生机制和物质基础，对于探索和发展辨证论治的疗效是十分必要的。在肝癌等肿瘤药效学和疗效作用机制的研究中，肿瘤小鼠是最常用的模式生物。我们的前期研究表明，H22等肿瘤小鼠会自发形成气血阴阳虚证，证情会发生自然演变和兼夹，与人类近似［2、3］，是研究同病异证和证候发生物质基础的理想实验动物;进而的研究发现同病异证肿瘤小鼠普遍存在神经-内分泌-免疫网络大量的基因表达差异和特征。最近，我们采用标准化、计量化小鼠诊法和辨证方法［4、5］，在同步接种 H22肝癌细胞的荷瘤小鼠中筛选出若干组同病异证小鼠，采用ELISA方法检测其血清中内分泌、免疫系统等多基因产物的含量，以进一步揭示其同病异证的物质基础，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及造模

(1)动物:清洁级KM小鼠250只，雄性，体质量22g±2g，购自上海斯莱克实验动物有限公司(动物生产许可证号为 SCXK(沪)2008-0003);动物使用许可证号为SYXK(沪)2009-0069;(2)随机取20只为正常对照;(3)230只小鼠腋下接种H22腹水癌细胞，细胞浓度为4×107/ml，每只小鼠右腋下接种0.2ml细胞悬液。出瘤后第6～7天淘汰死亡和未出瘤小鼠，余180只肿瘤小鼠。

1.2 同病异证肿瘤小鼠检测和筛选

1.2.1 接种后第7天诊法检测计量化检测指标［12、13］包括:(1)体重;(2)腋温;(3)旷场及计算35s内水平跨格数和垂直站立数;(4)抓力;(5)爪和尾显微拍照及提取反映红色程度的r值;(6)瘤长短径。

1.2.2 计量化辨证及证候严重度计算接种后第7天每只小鼠给予计量化辨证，证候及程度计算方法［1、2］如下:(1)估算瘤体积和瘤重(cm3)=abb/2(a代表肿瘤的长径，b代表肿瘤的短径，单位cm/g);(2)邪盛衰度 =瘤重/所有瘤重均数。辨证标准:大于1.5为邪毒甚，大于2为邪毒壅盛，小于0.75为邪较弱，小于0.5为邪弱;(3)气盛衰度=抓力/正常均数 ×0.5+水平/正常均数 ×0.3+站立/正常均数 ×0.2。辨证标准:与正常组比较，大于1.25为气盛，小于 0.75为气虚，小于 0.5为气虚甚，小于0.25为气亏;(4)阳盛衰度 =腋温/正常均数。辨证标准:与正常组比较，大于1.02为阳气盛，小于0.98为阳虚，小于0.95为阳虚重，小于 0.9为阳损;(5)阴盛衰度=去瘤体重/正常体重均数。辨证标准:与正常组比较，大于1.2为形丰，小于0.9为阴偏虚，小于0.85为阴虚，小于0.7为阴亏，小于0.6为液脱;(6)血盛衰度 =爪 r/正常均数 ×0.7+尾r/正常均数×0.3。辨证标准:与正常组比较，大于 1.1为血充盈，小于 0.95为血虚，小于 0.9为血虚重，小于0.85为血亏。

1.2.3 同病异证肿瘤小鼠筛选不同组别的同病异证小鼠筛选方法:(1)正常对照组(正常组)。取气血阴阳盛衰度居中者14只，其余淘汰。肿瘤小鼠以邪盛衰度大小排序，淘汰阳虚濒临死亡者;(2)邪毒壅盛濒危者(邪危组)。取邪盛衰度最为严重且兼有轻度阳气虚者21只(实际处死14只，以免次日部分自然死亡);(3)邪毒壅盛(邪毒组)。取邪盛衰度次于上组兼证少者17只(实际处死14只，以免次日部分自然死亡);(4)邪毒居中兼气虚小鼠14只(气虚组);(5)邪毒居中小鼠14只(邪中组);(6)邪毒微弱小鼠14只(邪微组)，其余肿瘤小鼠淘汰。

1.3 取材

(1)接种后第8天，摘除眼球取血制备血清，－80℃保存。各组取14只小鼠(邪危组随机淘汰3只存活小鼠);而气虚组仅存10只，邪中组13只。常规分离血清，血清样本少者2只样本合并，以保证同一份血清够检测所有指标;(2)引颈处死实验动物，分离肿瘤、睾丸、胸腺、脾脏等称重。

1.4 试剂盒及检测方法

采用的ELISA试剂盒及各自所提供的方法:(1)ACTH(1-39，mouse，rat)(美国，Peninsula Laboratories);(2)Mouse TSH(美国 Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.);(3)Mouse Aldosterone(美国，Assay Designs，Inc);(4)Mouse Tri-iodothyronine(美国，CALBIOTECH Inc.);(5)Mouse thyroxine(美国，CALBIOTECH Inc.);(6)Mouse Free Tri-iodothyronine Indes(武汉 EIAab Science Co.，Ltd);(7)Mouse Free Thyroxine(武汉EIAab Science Co.，Ltd);(8)Testoterone(美国，R＆D Systems，Inc.);(9)Mouse IL-2(美国，R＆D Systems，Inc.);(10)Mouse IL-10(美国，R＆D Systems，Inc.);(11)Mouse IL-12 p70(美国，R＆D Systems，Inc.);(12)Mouse TNF-α (美国，R＆D Systems);(13)Mouse IFN-γ(美国，R＆D Systems)

1.5 统计方法

(1)实验结果取存活并取材小鼠诊法和辨证指标统计，以便与各实验室检测指标比较:(2)采用单因素方差分析及SPSS15.0数据处理。

2 结果

2.1 各组小鼠存活情况

230只小鼠在接种后，第6天去除未出瘤或出瘤不佳如破溃等小鼠10只，剩余220只，当日有3只小鼠死亡。第7天，诊法和辨证前出现44只小鼠死亡，提示该批次实验荷瘤小鼠肿瘤发展快、预后差。

接种后第8天(处死小鼠当天)，邪危组21只中自然死亡4只，邪毒组17只中自然死亡3只，气虚组14只中自然死亡4只，邪中组14只中自然死亡1只(死亡率见图1)。提示:(1)邪盛衰度大小确与预后有关［2］;(2)本实验气虚组死亡率偏高，可能与气虚严重有关。

2.2 各组小鼠邪盛衰度与实际瘤重

(1)邪盛衰度。邪危组、邪毒组、气虚和邪中组、邪微组等邪盛衰度依次减小，除气虚组与邪中组接近外，差异均有统计意义(P＜0.05)，表明采用计量化辨证分组是可行的(图2);(2)次日肿瘤取材。邪危组、邪毒组、邪中组、邪微组等实际瘤重依次减轻，与邪盛衰度近似(图3)，其中邪中组、邪微组与其他组比较差异有统计意义(P＜0.05)，表明体表测量及计算瘤体积方法正确。值得注意的是，气虚组瘤重明显大于邪中组，提示在小鼠四诊检测到处死间约20h内，气虚组肿瘤增殖快，这也可能是该组死亡率高、预后差的原因。

2.3 各组小鼠气血阴阳盛衰度

(1)肿瘤发生后，荷瘤小鼠会自发形成气虚，并随着病情发展和邪盛衰度严重而加剧［2］。本实验结果近似，总体上邪盛衰度愈重气虚程度也愈重(图4);其中与正常组比较，邪危组、邪毒组、气虚组差异有统计意义(P＜0.05)。气虚组气盛衰度最小，除邪危组外，与其他组比较差异有统计意义(P＜0.05)。依据气盛衰度辨证标准［4、5］与正常组比较，小于0.5为气虚甚，表明本实验气虚组的气虚程度十分严重，这可能是其预后差的主要原因;(2)肿瘤发生后，荷瘤小鼠会自发形成阳虚，并随着病情发展与邪盛衰度严重而加剧［2］。本实验结果近似，总体上邪盛衰度愈严重阳虚程度也愈严重(图5)。其中与正常组比较，邪危组阴盛衰度下降，差异有统计意义(P＜0.05);(3)当肿瘤发展至中晚期，荷瘤小鼠会自发形成阴虚。本实验未见阴虚表现(图6);(4)肿瘤发生后，荷瘤小鼠会自发形成血虚，并随着病情发展和邪盛衰度严重而加剧［2］。本实验结果近似，总体上邪盛衰度愈严重血虚程度也愈严重(图7)。其中与正常组比较，邪危组、邪毒组血盛衰度下降，差异有统计意义(P＜0.05)。

图1 各组入选小鼠隔夜死亡率

图2 各组小鼠邪盛衰度

图3 各组小鼠瘤重

图4 各组小鼠气盛衰度

2.4 同病异证小鼠内分泌-免疫网络的特征

2.4.1 肾上腺轴 (1)在肿瘤发生的早期，应激使垂体ACTH合成与释放增加。本实验与正常组比较，各组均显著升高(P＜0.05)，且总体上与邪盛衰度呈正相关，但各组总量接近，没有显著差异(图8)。提示:对于邪毒壅盛及濒危荷瘤小鼠，垂体呈现出失代偿征兆;同时垂体储备有限，应激反应可能接近其极限;(2)与ACTH对应，肿瘤发生肾上腺醛固酮分泌增加，总体上与邪盛衰度呈正相关(图9)，邪中组与邪微组差异有统计意义(P＜0.05)。其中邪危组下调，提示该组小鼠肾上腺出现失代偿。鉴于醛固酮组间差异大，提示在受到ACTH的刺激后，还存在其他因素进一步调整和促进肾上腺醛固酮的分泌。

图5 各组小鼠阳盛衰度

图6 各组小鼠阴盛衰度

图7 各组小鼠血盛衰度

图8 各组小鼠血清ACTH含量

2.4.2 甲状腺轴 (1)从邪中组和邪微组血清TSH含量升高看(与邪危组、邪毒组、气虚组比较，差异具有统计意义，P＜0.05)，在肿瘤发生的早期，垂体TSH处于积极的应激反应状态(图10)。但随着肿瘤的增大，邪危组、邪毒组和气虚组 TSH含量下降。提示可能系垂体的储能有限，在尽力满足ACTH表达的同时，限制了 THS的表达;(2)与TSH对应，小鼠甲状腺T3、T4血清含量与肿瘤大小和增速负相关。在肿瘤早期，T3有升高趋势，而随着邪盛衰度程度增加，如邪危组显著下降，与邪中组比较，差异有统计意义(P＜0.05);而 T4在肿瘤发生后迅速抑制，与正常组比较，各组均显著下调(P＜0.05);其中邪中组、邪微组与其余肿瘤小鼠组比较，差异有统计意义(P＜0.05)。显然，与肾上腺轴相反，甲状腺轴以抑制为主(图11、12);(3)小鼠FT3、FT4血清含量T3、T4趋势一致，但可以维持在较高和正常水平，其中FT3显著升高(图13，正常组比较，除邪毒组外其他各组差异均有统计意义，P＜0.05)，邪中组、邪微组与其余肿瘤各组差异均有差异(P＜0.05);FT4总体上有升高趋势(图14)，其中邪微组与邪毒组、气虚组比较差异有统计意义(P＜0.05)，提示一些不明的机制在促进 T3、T4的转化和利用。

图9 各组小鼠血清醛固酮含量

图10 各组小鼠血清TSH含量

图11 各组小鼠血清T3含量

图12 各组小鼠血清T4含量

2.4.3 性腺轴 (1)在肿瘤发生的早期，荷瘤小鼠睾丸有重量减轻趋势，气虚组与各组比较下降显著(P＜0.05，图15)，提示气虚与性腺的关系密切，这也可能与该组预后差有关;(2)各组小鼠血清睾酮含量与THS模式近似:肿瘤早期邪毒微弱者有上调趋势，而邪毒壅盛和预后差者，显著下调(图16)。与肾上腺轴相反，性腺轴也以抑制为主。

图13 各组小鼠血清FT3含量

图14 各组小鼠血清FT4含量

图15 各组小鼠睾丸重量

图16 各组小鼠血清睾酮含量

2.4.4 免疫系统 (1)胸腺重量。在肿瘤发生的早期，荷瘤小鼠胸腺已见减轻，其中邪危组、邪毒组、气虚组与正常组比较，差异具有统计意义(P＜0.05);肿瘤邪毒程度严重者抑制更显著，其中危组、邪毒组、气虚组与邪中组比较，差异具有统计意义(P＜0.05)，气虚证尤甚(图17);(2)脾脏重量。在肿瘤发生的早期，荷瘤小鼠脾脏一致增重，与正常组比较差异有统计意义(P＜0.05)，但各肿瘤组间差距不大(图18);(3)IL-2。小鼠IL-2表达量低，且个体差异大。在肿瘤发生的早期，荷瘤小鼠血清IL-2水平呈下降趋势(图19)，与胸腺萎缩的趋势一致;(4)IL-10。荷瘤小鼠血清IL-10一致升高趋势，与肿瘤大小趋势一致，仅邪危组例外(图20);其中邪毒组与正常组比较，差异具有统计意义(P＜0.05);(5)IL-12。正常小鼠几乎检测不到，而荷瘤小鼠血清IL-12显著升高，与肿瘤大小趋势相反;气虚证预后差者例外(图21);(6)肿瘤坏死因子-α。小鼠TNF-α表达量低，正常小鼠检测不到且个体差异大。肿瘤发生后，TNF-α表达量上升，且与肿瘤体积呈负相关，仅邪微组除外(图22);(7)干扰素-γ。与TNF-α一致，肿瘤发生后 IFN-γ表达量上升，与正常组比较除邪微组外，差异均有统计意义(P＜0.05)，且与肿瘤体积呈负相关(图23)。

图17 各组小鼠胸腺重量

图18 各组小鼠脾脏重量

图19 各组小鼠血清IL-2含量

图20 各组小鼠血清IL-10含量

图21 各组小鼠血清IL-12含量

图22 各组小鼠血清肿瘤坏死因子-α含量

图23 各组小鼠血清干扰素-γ含量

3 讨论

3.1 肝癌小鼠的同病异证及实验设计考虑

接种同样数量的H22腹水癌细胞，在小鼠出瘤的早期肿瘤体积差异很大，是典型的“同病异证”。此外，部分小鼠还会出现典型的气虚，是同病异证的另一表现。鉴于邪盛衰度与预后有关［2］，观察不同程度的邪盛衰度小鼠内分泌和免疫系统的改变是揭示其同病异证物质基础的有效途径。因此，我们依据邪盛衰度筛选并分成4个组别:邪危组、邪毒组、邪中组、邪微组。同时鉴于气虚是该阶段常见兼证，筛选出邪毒居中兼气虚小鼠(可与邪毒居中对照)。这样，与正常对照组一道共计6个组别，便于相互比较与对照。

3.2 以肿瘤大小作为辨证条件依据

中医学辨证论治往往抓住反映证候本质的四诊信息，而不在于四诊信息采集的多寡［6］，因而有“但见一证便是”的说法。肿瘤体积的大小，综合反映了痰热瘀毒病邪的严重程度。在相同造模条件下(接种同样数量的肿瘤细胞，以及接种后相同的时间)，肿瘤体积大者，痰热瘀毒邪盛，肿瘤发生和增殖快，预后差;肿瘤体积小者，痰热瘀毒邪微，肿瘤发生和增殖慢，预后好［2］。依据我们以往大量的研究，以及本实验结果看，按肿瘤体积的大小筛选的同病异证小鼠，的确存在内分泌和免疫客观的差异和特征性的表现，验证了辨证的合理性及其同病异证的客观性。邪毒证候的形成确有其复杂的内在物质基础。

3.3 因实致虚和因虚致实的因果关系

与人类肿瘤的发生机制不同，H22荷瘤小鼠没有长期的肝脏受损、纤维化和异常增殖等背景，之前的免疫系统也处于正常状态，所有的改变均发生在外来肿瘤细胞的接种之后。因此，从发病学角度看，是因实致虚(甲状腺轴、性腺轴机能减退以及气血阴阳虚证的发生)。但是，为什么接种同样数量的肿瘤细胞会发生如此多变的同病异证呢?其内分泌、免疫系统与证候严重程度的对应性改变，可能与肿瘤细胞及接种局部环境、内分泌和免疫储备差异有关，这还需要更多的实验去解释。