降糖三黄片对糖尿病心肌病大鼠心室重构的电镜观察*

王慧睿，李赛美，王保华，熊学军，陈 云，林 洁

糖尿病心肌病的病理生理特点为左心室舒张功能障碍，晚期也有收缩功能减低，心肌及间质细胞的重构是糖尿病心肌病左心室舒张和收缩功能障碍的主要原因之一，目前临床尚缺乏有效治疗。降糖三黄片是针对2型糖尿病气阴不足、瘀血阻络的病机，由《伤寒论》经方桃核承气汤加味研制而成。前期研究已发现，加味桃核承气汤对2型糖尿病及其心血管并发症具有一定的防治作用［1-3］。本文在此基础上进一步观察糖尿病心肌病发生心室重构时的超微结构变化以及中药降糖三黄片对其的防治作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及造模 SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体重50g～80g，购自南方医药大学实验动物中心(广东省实验动物检测所，合格证001号，环境设施合格证028号)。所有大鼠普通饲料(总热量6.94J/g，其中蛋白质23%，碳水化合物53%，脂肪5%(购自广东省实验动物中心)适应性喂养1周后，改用高脂饲料(总热量4.9kcal/g，其中蛋白质20%，碳水化合物35%，脂肪45%，蛋氨酸按1%比例添加，购自广东省实验动物中心)喂养1个月。造模前禁食12h，造模组按30mg/kg剂量腹腔内注射STZ(溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5)，正常组腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液。1周后，测定空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)和空腹胰岛素(Fasting insulin，FINS)，计算胰岛素敏感指数［Insulin sensitive index，ISI，ISI=In(FINS ×FBG)－1］。连续2次空腹血糖≥11.1mmol/L，查尿糖++以上，胰岛素敏感指数降低，且有多饮、多尿、多食现象，确认为2型糖尿病模型。2型糖尿病大鼠成模后，给予高脂饲料连续喂养8周，即出现糖尿病大鼠心肌病变［4］。

1.1.2 试剂及药品 链脲佐菌素购自Sigma公司;降糖三黄片为广州中医药大学院内制剂，规格为每片0.25g;卡托普利片(商品名:开博通)为中美上海施贵宝制药有限公司，规格为每片12.5mg。

1.1.3 主要仪器 美国雅培公司快速微量血糖仪;Acuson sequoia 512高频超声诊断仪;Hitachi H-7500透射电子显微镜购自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 Wistar大鼠随机分为正常组与造模组(含模型组与治疗组)。糖尿病造模成功后造模组进一步分层，随机分为模型组、降糖三黄片干预组、卡托普利干预组。49只大鼠完成实验，正常组10只，模型组13只，降糖三黄片干预组13只，卡托普利干预组13只(余5只或死亡或不符合条件)。中药组(降糖三黄片)药量按787.5mg/(kg(d)的剂量给予，西药组(卡托普利)药量按照4mg/(kg(d)的剂量给予，正常组及模型组灌服等量蒸馏水。

1.2.2 生化指标测定 STZ注射1周后，大鼠禁食12h后空腹眼眶静脉窦采血。糖尿病大鼠造模成功后8周，处死前腹主动脉采血检测FBG、胆固醇和甘油三酯以及胰岛素。

1.2.3 心功能的超声检测［5］实验末行超声心动图检查。二维超声检测指标包括左室舒张末期内径(LVED，mm)、左室射血分数(LVEF，%)，组织多普勒指标包括左室侧壁二尖瓣环收缩期最大运动速度(Sm，cm/s)、舒张早期最大运动速度(Em，cm/s)、舒张晚期最大运动速度(Am，cm/s)和舒张早期与舒张晚期最大运动速度比值(Em/Am)。

1.2.4 取材及电镜标本制作 经心脏超声检查后，迅速打开胸腔摘取心脏，以冰冷的生理盐水冲洗去血液，小心剪去连接心脏的血管，用滤纸吸干水迅速以电子天平称全心重量;沿房室交界处剪去心房部分，将余下的室间隔、左室游离壁作为左室重量(Left ventricles weight，LVM)，左室重量与体质量的比值分别作为左室重量指数(LVMI，mg/g)。再将左心室切成1mm3小块，先用体积分数为2.5%戊二醛固定，0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)冲洗，再用10g/L锇酸固定，PBS洗，酒精丙酮系列脱水，Epon812环氧树脂包埋，AO超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，最后置透射电镜下观察拍照。

1.3 统计学处理

所有数据均以珋x±s表示。采用统计学软件包SPSS13.0进行统计分析，多样本均数间比较采用one-wayANOVA检验，组间比较采用 LSD-t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量及生化指标比较(见表1)

表1 各组大鼠体质量及生化指标比较(珋x±s)

表2 各组大鼠超声心动图指标比较(珋x±s)

2.2 降糖三黄片对糖尿病心肌病大鼠心功能的影响(见表2)

2.3 降糖三黄片对糖尿病心肌病大鼠左心室重量指数的影响(见表3)

表3 各组大鼠心脏重量、左心室重量及左心室重量指数改变(珋x±s)

2.4 降糖三黄片对糖尿病心肌病大鼠心肌超微结构的影响(图1)

2.4.1 正常组心肌细胞超微结构 心肌组织由众多的心肌细胞组成，心肌细胞有分枝，细胞间由闰盘相连，形态正常。胞核位于心肌细胞中央部位，呈长杆状，核内以常染色质为主，少量异染色质分布于核膜下或分散存在于核质中，两层核膜清晰可辨;细胞纵切面可见胞浆充满大量纵向平行排列的肌原纤维;I带、A带、H带与 Z线、M线均明显易辨，形成明暗相间的肌节结构;胞浆中有丰富的线粒体，位于核旁与与肌原纤维束间，呈圆形或卵圆形，其嵴密集，排列有序，充满整个线粒体内腔。

2.4.2 模型组心肌细胞超微结构 心肌细胞纵切面可见肌原纤维排列紊乱、断裂、分离、局部溶解;线粒体肿胀，外膜不完整，嵴减少与稀疏，部分线粒体缺失;胞核染色质凝聚，核膜不完整并呈节段性溶解消失病变。

2.4.3 卡托普利组心肌细胞超微结构 心肌细胞超微结构也较接近正常，细胞核长杆状，位于细胞中央，形态与正常组相似，肌原纤维无病变，线粒体形态轻度肿胀，个别有畸形病变;胞核染色质有轻度凝聚现象。

2.4.4 降糖三黄片组心肌细胞超微结构 心肌细胞超微结构接近正常组，胞核长杆状，位于细胞中央，形态正常;肌原纤维排列整齐，与正常组相近;线粒体形态轻度肿胀，胞核染色质有轻度凝聚现象。

3 讨论

图1 糖尿病大鼠心肌细胞超微结构的电镜观察(放大比例为×8000，标尺为1 m)

糖尿病心肌病是一种独立的糖尿病并发症，其临床特征以左室舒张功能障碍为主，随着病程的进展也会出现收缩功能降低，逐渐发展为充血性心力衰竭［6］。心室重构是指心室结构改变，包括心肌细胞肥大、间质细胞如成纤维细胞的增殖及胶原组织增生等，同时心脏的功能也受到明显影响。随着心肌肥厚以及心室重构的发生和发展，心律失常、心衰和猝死的发生率也随之提高。目前的治疗仍局限在以控制血糖为基础，尚无特异有效的治疗方法。中医药以整体调节、毒副作用小在糖尿病心肌病心室重构的调节方面具有独特的优势。针对2型糖尿病气阴不足、瘀血阻络的病机，我院由《伤寒论》经方桃核承气汤加味研制而成中药降糖三黄片，具体药物有北黄芪、大黄、生地、桃仁、玄参、麦门冬、桂枝、甘草、玄明粉，在临床运用取得良好效果。运用现代科学技术与手段，探讨糖尿病心肌病心室重构的发病机制，对进一步提高疗效、拓展中药降糖三黄片在临床的应用范围具有重要意义。

本研究以高脂高热量饲料诱导加小剂量链脲佐菌素注射建立动物模型，具有中度胰岛素抵抗、中度高血糖、高血脂等表现，基本符合2型糖尿病的临床特点。电镜检查显示，大鼠心肌细胞排列紊乱，肌原纤维呈灶性溶解，线粒体肿胀，外膜不完整，嵴减少与稀疏，胞核染色质凝聚，核膜不完整并呈节段性溶解消失，与以往报道的糖尿病心肌超微结构改变一致。超声心动图检查显示，在模型组反映左室舒张功能的指标Em/Am显著降低，反映左室收缩功能的指标LVEF和Sm显著降低，提示本研究建立的动物模型符合2型糖尿病心肌病。在此基础上发现，实验末模型组大鼠左室重量、左室重量指数均显著增加，说明在糖尿病心肌病基础上出现了心室的重构，为今后糖尿病心肌病心室重构的实验研究提供了良好的载体。

研究结果表明，中药降糖三黄片不仅能缓解糖尿病大鼠“三多一少”的临床症状，在客观指标上还能够有效地降低血糖、血脂水平，减轻胰岛素抵抗，全面改善2型糖尿病所导致的糖脂代谢紊乱状态，这与既往关于加味桃核承气汤改善糖脂代谢紊乱的报道一致［7、8］。超声心动图及透视电子显微镜观察中药降糖三黄片能够改善心功能各项指标，降低左室重量指数，有效改善糖尿病心肌病大鼠的心肌超微结构，逆转其心室重构的过程，其效果与西药卡托普利相似，2组比较无统计学差异(P＜0.05)。推测其作用机制如下:①通过其对糖尿病的血糖控制，延缓糖尿病心肌病的发生，改善其预后;②降糖三黄片中活血通络的成分如桃仁、桂枝、大黄等能够改善心肌的微循环，从而起到延缓糖尿病心肌病发生发展的作用;③降糖三黄片的作用效果与卡托普利有相似之处，是否其作用机制也通过作用于血管紧张素转换酶途径需要进一步进行深入研究。

［1］ 李赛美，熊曼琪，林安钟，等.中医不同治法对糖尿病大鼠冠状动脉结扎致心肌缺血预防作用的对比观察［J］.中国中西医结合杂志，2000，20(6):438-440.

［2］ 李赛美，熊曼琪，林安钟，等.不同造模法糖尿病大鼠心肌电镜观察及对中药效应的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2000，6(6):14-16.

［3］ 李赛美，储全根，莫 伟，等.加味桃核承气汤及提取物对糖尿病大鼠主动弓病变影响的电镜观察［J］.广州中医药大学学报，2005，22(2):134.

［4］ 李赛美，吴玲霓，储全根，等.加味桃核承气汤及其不同提取物对糖尿病大鼠心肌细胞超微结构的影响［J］.北京中医药大学学报，2005，28(3):236.

［5］ Julius M.Gardin， Francis M Siri， Richard N，et al.Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice Leinwand［J］.American Heart Association，Inc Circulation Research，1995，76:907-914.

［6］ Hayat SA，Patel B，Khattar RS，et al.Diabetic cardiomyopathy:mechanisms，diagnosis and treatment［J］.Clin Sci(Colch)，2004，107(6):539-557.

［7］ 熊曼琪，梁柳文，林安钟，等.加味桃核承气汤治疗2型糖尿病的临床和实验研究［J］.中国中西医结合杂志，1992，12(2):74-76.

［8］ 熊曼琪，林安钟，朱章志，等.加味桃核承气汤对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响［J］.中国中西医结合杂志，1997，17(3):165-168.