坝上油菜蜂花粉中多糖和乙醇提取物对亚硝酸盐清除作用的研究

梁岩冰，许丽娟，王治宝

（1．张家口市食品药品监督管理局人事培训科，河北 张家口075000；2．张家口第四医院药剂科，河北 张家口075000；3．河北北方学院基础医学院，河北 张家口075000）

N－亚硝基化合物是目前所知的最强的化学致癌物之一，能引起人和动物的胃、肝脏等多种器官的恶性肿瘤．亚硝酸盐是N－亚硝基化合物的合成前体．尤其是在人和动物的胃内，特别适于N－亚硝基化合物的合成［1］．因此清除亚硝酸盐是阻断致癌物的产生、防治癌变的有效措施之一．

蜂花粉 （bee pollen）中含有丰富的蛋白质、氨基酸、糖类、黄酮、各种活性酶、激素、维生素和矿物质等，不仅是一种天然的完全营养型的滋补品，而且还是治疗各种疾病的名贵药材［2］．本实验采用水提醇沉法提取油菜蜂花粉中多糖，采用超声法制备油菜蜂花粉乙醇提取液，然后在体外模拟胃液条件下，研究油菜蜂花粉多糖和乙醇提取物清除亚硝酸盐的作用．

1 仪器与药品

仪器：HITACHI U－3900紫外分光光度计 （天美科技有限公司）；GOA－型电热真空干燥箱 （天津东郊机械加工厂）；DL－720超声波仪 （宁波江南仪器厂，45 KHz±5%）．

药品：葡萄糖标准品，芦丁标准品由中国药品生物制品鉴定所提供，油菜蜂花粉为市场购买，于硅胶干燥器中干燥两天后备用，其余试剂均为分析纯．

2 实验方法与结果

2．1 油菜蜂花粉中黄酮和多糖的含量测定

2．1．1 乙醇提取物的制备

称取油菜蜂花粉20．00 g，以95%乙醇为溶剂微波处理30 s［3，4］．浸泡24 h后，于70℃超声提取3次，每次25 min，料液比依次为1∶10、1∶15、1∶20，合并滤液，滤渣留待提取多糖．滤液减压浓缩至无醇味，移至培养皿中烘干，称重待用．

2．1．2 蜂花粉总黄酮的含量测定

精密称取芦丁标准品0．015 0 mg，置于25 ml容量瓶中，加7．5 ml无水乙醇完全溶解后，加三蒸水定容至刻度，摇匀后作为储备液．准确量取上述芦丁标准溶液0．25 ml，0．50 ml，0．75 ml，1．00 ml，1．25 ml，1．50 ml于6只10 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠0．30 ml，摇匀，放置6 min后加入10%硝酸铝0．30 ml，摇匀，放置6 min后加入4%氢氧化钠4．00 ml，混匀，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置12 min后以试剂作空白，于510 nm处测其吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：C＝0．1002 A＋0．0016，r＝0．999 8．结果表明在浓度为0．01 mg／ml～0．09 mg／ml范围内与吸光度呈良好线性关系．根据标准曲线求得油菜蜂花粉总黄酮含量．按下式计算总黄酮得率．结果总黄酮的含量以芦丁记为2．43%，RSD＝1．78%．

2．1．3 蜂花粉多糖的提取

利用水提醇沉法提取花粉多糖［5］．称取上述滤渣，加8倍量蒸馏水，微沸煎煮1 h，过滤，残渣用6倍量蒸馏水煎煮1 h．合并滤液，加无水乙醇至醇含量达80%，静置过夜，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，得灰白色粗多糖，于真空干燥器中干燥后称重，待用．

2．1．4 蜂花粉多糖的含量测定

精密称取葡萄糖对照品100．4 mg，置100 m L的容量瓶中，加水溶解定容，摇匀，即葡萄糖贮备液．精确吸取葡萄糖贮备液适量，分别加水稀释制成0．02 mg／ml、0．04 mg／ml、0．06 mg／ml、0．08 mg／ml、0．10 mg／ml、0．12 mg／ml的溶液，摇匀．分别精确吸取上述不同浓度溶液1．0 m L，置锥形瓶中，均加10%苯酚溶液1 m L，摇匀，迅速加入浓硫酸5．0 m L，立即摇匀，室温放置30 min，平行空白，在490 nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线．得回归方程C＝0．0174 A＋0．0002，r＝0．9997．结果表明在浓度为0．005～0．03 mg／ml范围内与吸光度呈良好线性关系．根据标准曲线求得油菜蜂花粉多糖含量．按下式计算总多糖得率．多糖含量 （%）＝C×D×100／W．结果花粉多糖含量以葡萄糖记为10．79%，RSD＝5．52%．

2．2 油菜蜂花粉乙醇提取物和花粉多糖对亚硝酸盐清除作用的研究［6］

分别吸取油菜蜂花粉多糖贮备液或乙醇提取物贮备液0．00、1．00、3．00、5．00、7．00 ml于50．00 ml容量瓶中，加入25．00 ml p H3．0的柠檬酸钠－盐酸缓冲液，再加入100 mg／ml的Na NO2溶液5．00 ml，用蒸馏水定容．在体外模拟胃液，37℃下恒温1h后吸取1．00 ml反应液于7 cm2的培养皿中，加入0．4%的对氨基苯磺酸溶液2．00 ml，0．1%α－萘胺溶液2．00 ml，摇匀，放置15 min后，于525 nm处测吸光度值 （Ax），同时用蒸馏水做空白实验 （A0），则亚硝酸盐的清除率为：清除率＝（A0－Ax）／A0×100%．

结果表明清除率大小随多糖和乙醇提取物的浓度变化而变化．花粉乙醇提取物加样浓度为2．333 mg／ml时对亚硝酸钠的清除率最大，清除率为25．37%，见图1．花粉多糖在加样浓度为4．317 mg／ml时对亚硝酸钠的清除作用最大，清除率为41．70%．见图2．

图1 乙醇提取物对亚硝酸钠的清除作用

图2 多糖对亚硝酸钠的清除作用

3 讨 论

采用微波对花粉进行破壁处理后，其内含营养物质可得以充分释放，各种活性成分的提取分离相对容易．微波萃取具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂、污染小等特点．

亚硝酸盐在弱酸性条件下，与氨基苯磺酸重氮化后，再与α－萘胺偶合生成红色的化合物，用分光光度法测定亚硝酸盐的含量．同样条件下加入样品液，样品对亚硝酸盐清除以后，再用上述方法测定剩余的亚硝酸盐含量，进而可计算出被清除的亚硝酸盐的量．

结果表明坝上油菜蜂花粉多糖和乙醇提取物对亚硝酸盐均有一定清除作用．其中多糖清除亚硝酸盐的作用接近山楂和洋葱提取物对亚硝酸盐的清除作用［6，7］．

［1］ 宋茹，伟荣．微波法浸提桔皮类黄酮及其对NO2－清除作业的研究 ［J］．食品研究与开发，2007，28 （07）：25－28

［2］ 郭奕明．花粉与营养保健 ［J］．植物杂志，2002，（06）：39－40

［3］ 卢挺．青藏高原油菜蜂花粉酶解破壁研究 ［J］．食品科学，2002，23（03）：126－127

［4］ 杨志岩，尹树花．油菜花粉中总黄酮的提取研究 ［J］．现代食品科技，2007，24（02）：164－166

［5］ 杨辉，赵媛．苯酚－硫酸法测定桃叶鸦葱根中多糖的含量 ［J］．河北北方学院学报：自然科学版，2010，27（05）：19－21

［6］ 赵二劳，王晓妮，张海容，等．山楂清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究 ［J］．食品与发酵工业，2006，32（10）：29－31

［7］ 郭艳华，张玉敏．洋葱提取物清除亚硝酸盐的研究 ［J］．化学研究与应用．2008，20（08）：1084－1086