甘草不定根培养的研究*

张 坚 ，高文远 ，，4，王 娟 ，吕连媛

（1.天津中医药大学中药学院，天津 300193；2.天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津 300457；3.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072；4.天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

甘草不定根培养的研究*

张 坚1，2，高文远1，2，3，4，王 娟3，吕连媛2，4

（1.天津中医药大学中药学院，天津 300193；2.天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津 300457；
3.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072；4.天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

[目的]考察甘草不同外植体与外源性激素诱导不定根能力，为甘草不定根培养做基础研究。[方法]切取乌拉尔甘草无菌实生苗的根、叶、带芽茎段接种到含有不同外源性激素的不定根诱导培养基中，考察不同外植体诱导生根的能力，并在此基础上进行不定根增殖尝试。[结果]不同外植体以及不同类型和浓度的外源性生长素对不定根诱导能力不同。根和叶诱导不定根效果好于带芽茎段；萘乙酸（NAA）较吲哚丁酸（IBA）更有利于不定根的诱导，6-苄氨基嘌呤（BA）则抑制不定根的诱导；不同类型的外植体诱导生根的生长素（NAA）适宜浓度存在差异，其中根段在0.2～1 mg/L，真叶在3～5 mg/L，带芽茎段在1～3 mg/L诱导效果较好。[结论]甘草不同外植体在含有外源性生长素的培养基中均可以诱导生根，但细胞分裂素强烈的抑制生根；根段和真叶作为外植体是甘草不定根诱导较为理想的材料。

甘草；不同外植体；外源性激素；不定根

乌拉尔甘草（Glycyrrhiza Uralensis Fisch.G.Glabra L.）为甘草正品，别名甜草、蜜草，为豆科甘草属多年生草本植物，是荒漠半荒漠地区重要的固沙植物，同时也是接近濒危的大宗道地药材，此外甘草还广泛用于食品、饮料、卷烟业和化妆品工业，具有重要的生态和经济价值[1-2]。由于中国野生甘草遭到无计划的毁灭性采挖，导致野生甘草资源日趋枯竭，

甚至面临灭绝危险[2]。目前，中国甘草资源主要是通过传统人工栽培方式获得。在甘草组织培养方面，有关于甘草组培苗快繁的报道[3]以及甘草悬浮细胞培养的研究[4]，但还没有关于甘草不定根培养的研究报道。本研究通过不定根培养的方式直接获得甘草不定根，为甘草药材资源更新进行新的尝试。

1 材料与方法

1.1 材料 乌拉尔甘草种子购自北京时珍中草药技术（集团）有限公司

1.2 方法

1.2.1 甘草无菌苗的获得 取乌拉尔甘草种子 [已用浓硫酸（H2SO4）处理]，流水冲洗 1 h，将种子放入超净台上，70%的乙醇中浸30 s，用无菌水冲洗2～3次，再用4%次次氯酸钠（NaClO）浸泡 20 min，无菌水冲洗5次，吸干材料表面水分后接种到无激素的MS固体培养基上，培养温度（25±1）℃，光照16 h/d，光照强度 2 500～3 000 lx，蔗糖 30 g/L，初始pH 6.0。3～5 d左右甘草种胚萌动，培养20 d左右胚芽可长高6～8 cm，每株含3～4片真叶。

1.2.2 外植体在含不同外源性生长素以及在同时添加细胞分裂素的培养基上诱导生根 切取无菌苗中真叶、带芽茎段、根为考察外植体，分别接入到含萘乙酸（NAA）或吲哚丁酸（IBA）1 mg/L的1/2MS固体培养基上，观察不同类型外植体在不同外源性生长素条件下的生根情况。此外，为了考察细胞分裂素对外植体生根的影响，实验中在添加生长素NAA同时，还分别添加0.2 mg/L的细胞分裂素[6-苄氨基嘌呤（BA）或激动素（KT）]。外植体中根和带芽茎段均切成1 cm左右的切段，平放于培养基中；真叶选择1 cm2左右，带部分叶柄，在叶片上横向切2～3刀至中脉，背面朝下紧贴培养基中。培养温度（25±1）℃，暗培养，蔗糖30 g/L，初始pH 6.0。每个处理30个外植体，重复2次。

1.2.3 外植体在含不同浓度的生长素NAA的培养基上诱导生根 切取无菌苗中真叶、带芽茎段、根为考察外植体，分别接入到含 NAA0.2、0.5、1、3、5 mg/L的1/2MS固体培养基上，观察不同类型外植体在不同浓度的NAA条件下诱导生根的情况。外植体的处理同1.2.2，培养条件除外源性激素外同1.2.2。每个处理30个外植体，重复2次。

1.2.4 不定根继代增殖 将由根段和真叶诱导所获得的不定根进行继代增殖，培养条件为1/2MS+NAA1 mg/L，培养温度（25±1）℃，暗培养，蔗糖 30 g/L，初始pH 6.0。

2 结果与分析

2.1 外植体与不同类型外源性激素 不同类型的外植体在含有外源性生长素NAA或IBA的培养基中均可诱导出不定根（见表1，图1～3）。一般在12 d左右可以用肉眼看到外植体表面产生白色不定根，但不同外植体在不同外源生长素诱导下不定根的诱导和生长存在明显差异。NAA更有利于不定根的诱导，不同外植体在NAA诱导下生根率均超过50%，且比相应IBA诱导的生根率和生根数明显要高，但从不定根的生长情况看，IBA似乎更有利于不定根的生长，尤其是带芽茎段和真叶。此外，实验中发现向培养基中添加细胞分裂素（BA和KT）后，外植体表面仅出现愈伤组织，但无不定根发生，这说明细胞分裂素抑制了甘草不定根的发生。

表1 不同外植体在添加不同外源生长素（1 mg/L）或兼有细胞分裂素（0.2 mg/L）的培养基中诱导下生根情况Tab.1 Rooting situation of different explants in the mediumwith different auxin(1 mg/L)or having cytokinin(0.2 mg/L)

2.2 外植体与不同浓度的NAA 生长素作为植物重要的生理活性物质，不仅有利于外植体生根，同时也有利于外植体愈伤化。实验中，随着外源生长素NAA浓度的提高，外植体愈伤化程度不断增强，但诱导生根的效果却存在明显的差异（见表2）。可以看出，外植体根段仅在低浓度NAA（0.2～1 mg/L）时诱导生根效果较好，随着NAA浓度的增加，愈伤化逐渐增强，其不定根诱导能力明显减弱，当NAA浓度增加到5 mg/L时，外植体完全丧失生根能力；真叶则和根段诱导效果相反，当NAA浓度较低时，真叶诱导生根能力较差，随着NAA浓度的增加，愈伤化加强，其不定根诱导能力也随之加强，当NAA浓度增加到3 mg/L时，生根效果最好，进一步增加NAA浓度，发现虽然生根率和生根数很高，但不定根生长缓慢。带芽茎段生根特点接近于根段。从上面分析，可以推测不同类型的外植体诱导生根的机制可能存在差异。外植体根段最有可能是直接诱导生根，故当NAA浓度增加时，根段表面愈伤组织的产生会抑制外植体中根原基的产生，故在NAA升高到5 mg/L时，没有生根；而真叶可能更多的是通过愈伤组织的分化而实现不定根的诱导，虽然在低浓度时，真叶切口处亦可直接产生不定根，但不定根的诱导率和平均不定根数目很低，而增加NAA浓度后，真叶表面愈伤组织增加的结果使得不定根的诱导率和不定根数呈现明显上升的趋势，当NAA浓度升高到5 mg/L时，愈伤组织表面出现大量短小的不定根，这说明真叶主要是通过愈伤组织的分化间接诱导不定根，而在外植体表面直接诱导不定根效果较差。带芽茎段诱导生根的机制似乎接近于外植体根段，及当NAA处于低浓度时，外植体表面直接诱导不定根发生，NAA浓度增加则愈伤化程度增加，影响其生根能力。

2.3 继代增殖 实验中发现选择带有少量愈伤组织的不定根进行继代培养效果优于缺乏愈伤组织的不定根，但不定根在继代时的生长速度仍不令人满意（见图4），其原因可能和外源性生长素有关，即单独使用NAA虽然有利于甘草外植体诱导不定根的产生，但可能不利于不定根的生长，故如何使诱导出?的不定根在继代增殖过程中既保持较强的不定根诱导能力，又可让不定根获得较好的生长速度将是下一步重点考察的问题。笔者将对外源性生长素NAA和IBA的激素组合进行考察，希望能找到既有利于不定根诱导增殖又有利于不定根生长的培养条件。

图1 真叶诱导不定根Fig.1 Inducing adventitiousroots with leaves

图2 带芽茎段诱导不定Fig.2 Inducing adventitiousroots with stems with buds

图3 根段诱导不定根Fig.3 Induce adventitiousroots with roots

图4 不定根继代增殖Fig.4 Secondary cultureof adventitious roots

表2 不同外植体在不同浓度的NAA诱导下生根情况Tab.2 Rooting situation of different explant in the differentconcentration of NAA

3 结论

甘草根、茎、叶均可在一定条件下诱导生根，但不同外植体在外源性生长素诱导下不定根的分化能力和生长明显不同，表现出明显的异质性。其中根和叶的诱导效果较好，带芽茎段明显弱于前两者。生长素中NAA更有利于诱导甘草外植体生根，细胞分裂素则抑制生根。

NAA在0.2～1 mg/L有利于外植体根段诱导不定根；NAA在1～3 mg/L有利于茎段诱导不定根；NAA 3～5 mg/L有利于真叶诱导不定根。

[1] 张 继,姚 健,丁 兰,等.甘草的利用研究进展[J].草原与草坪,2000,20(2):12-17.

[2] 王照兰,杜建材,于林清,等.甘草的利用价值、研究现状及存在的问题[J].中国草地，2002,24(1):73-76.

[3] 范小峰,杨颖丽,郭晓强,等.乌拉尔甘草不同外植体愈伤组织的诱导及影响因子研究[J].中药材，2009,32(2):173-176.

[4] 卞爱华,高文远,王 娟.不同诱导子对甘草悬浮培养细胞中甘草酸积累的影响[J].中国药学杂志，2008，43(22).1690-1693.

[5] 陈 巍,于泉林,高文远,等.甘草愈伤组织培养的研究[J].中国中药杂志，2005,30(9):713-715.

Studies on culture of adventitious roots of liquorice

ZHANG Jian1，2，GAO Wen-yuan1，2，3，4，WANG Juan3，et al
（1.School of Traditional Chinese Materia Medica ，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China； 2.Key> laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China; 3.School of Pharmaceutical Science and Technology， Tianjin University， Tianjin 300072， China； 4.College of Bioengineering， TianjinUniversity of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

[Objective]To study the ability of inducing adventitious roots of different explants and exogenous hormones in order to provide the fundamental researches for the culture of adventitious roots of liquorice.[Method]Cut the roots,leaves and stems with buds of sterile seeds and inoculate them to the induction medium with different exogenous hormones.Inspect the rooting abilities of different explants and try to propagate the roots on this basis.[Result]Different explants and different types and concentrations of exogenous auxins have different inducing ability to adventitious roots.Roots and leaves’effects of inducing adventitious roots are better than that of stem with bud.NAA is better in favor of inducing adventitious roots than IBA.However,BA restraints the inducement of adventitious roots.Different types of explants have different fitting concentrations of auxin(NAA)in inducing roots.The preferable inducing effect is the concentration of NAA at 0.2～1 mg/L to root,3～5 mg/L to leaf,1～3 mg/L to stem with bud.[Conclusion]All different explants of liquorice can induce adventitious roots in the culture medium with exogenous auxin,however,exogenous cytokinin restraints the inducement of roots.The roots and leaves are ideal explants of liquorice for inducing adventitious roots.

Glycyrrhiza Uralensis Fisch.G.Glabra L.;different explants;exogenous hormones; adventitious root

R285.5

A

1672-1519(2011)01-0075-03

天津市科技支撑计划重点项目（09ZCKFSH 01100）。

张 坚（1974-），男，博士，副教授，主要从事生药和组织培养工作。

高文远。

2010-09-20）