枯草芽胞杆菌B－FS01对葡萄霜霉病的防治效果

陈 浩， 胡梁斌， 唐春平， 胡 健， 石志琦＊

（1．扬州大学环境科学与工程学院，扬州 225009； 2．江苏省食品质量安全重点实验室－省部共建国家重点实验室培育基地，农业部食品安全监控重点开放实验室，南京 210014；3．河南科技学院食品学院，新乡 453003）

葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌［Pl asmopar a viticol a （Ber k．et Curtis．）Berl．et de Toni．］引起的一种世界性病害，所有种植葡萄的区域都有发生，严重危害葡萄的叶片和嫩梢，影响树势和产量。生产上防治霜霉病及卵菌纲的常用化学药剂苯基酰胺类（phenyla mides，如甲霜灵等），氨基甲酸酯类（carba mate，如霜霉威等），甲氧基丙烯酸酯类（str obil urins，如嘧菌酯等），吗啉类（morpholine，如烯酰吗啉等）均已存在不同程度的抗药性［1－5］，同时导致农药残留，环境污染等问题。近年来国家引导和鼓励农药研制向绿色环保方向发展，因此研究生物防治技术有着现实意义。

B－FS01是江苏省农业科学院从感染油菜菌核病菌的油菜茎秆上分离得到的1株广谱性拮抗菌，经鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacill us subtilis）。对其抗菌物质分离纯化，经分析为fengycins和surf actins脂肽类抗菌物质。此类抗菌物质属于细菌分泌的非核糖体合成多肽，组成中包括一些非蛋白质源的氨基酸甚至一些其他的化合物，结构上往往是环化的，这种特殊的结构有利于它们特定功能的稳定和发挥。非核糖体合成多肽中应用较广泛的有青霉素、万古霉素、放线菌素 D 等［6－8］。

芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌因其自身能产生耐热、抗紫外线等抗逆的内生孢子和稳定的抗菌物质，容易在环境中长时间存活，成为土壤及其他环境中的优势微生物菌群，所以是常用的生防菌筛选对象［9－10］，被作为防治对化学药剂产生抗性病原菌的方法之一［11］，许多已被成功应用于生物防治中［12－14］。在前期试验中已经确定 B－FS01牛肉膏蛋白胨发酵液对葡萄霜霉病菌有一定的效果，本文进一步将B－FS01发酵液制成了一种可湿性粉剂，并明确了B－FS01对葡萄霜霉病的实际防治效果。

1 材料与方法

1．1 供试材料

枯草芽胞杆菌菌株B－FS01由油菜茎秆分离获得，目前已委托中国微生物菌种保藏中心保藏（保藏号1233）；72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂，上海杜邦农化有限公司生产；十二烷基磺酸钠，白炭黑等，江苏省苏科农化有限责任公司提供；小型气流粉碎机。

1．2 B－FS01及其无菌滤液对葡萄霜霉病菌抑制作用

因葡萄霜霉病菌只能活体培养，故采用叶盘保湿法［15－16］测定B－FS01对葡萄霜霉病菌的室内抑制活性。试验设6个处理，B－FS01牛肉膏蛋白胨发酵液（30℃，120 r／min培养72 h，菌体含量2．6×109个／mL）无菌水稀释成菌体含量105、106、107个／mL，B－FS01无菌滤液（发酵液过0．22μm细菌过滤器），72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂600倍稀释液，无菌水对照。从江苏省南京市江心洲精品果园采集发病叶片和新梢第4～6轮未发病叶片（感病品种‘红宝石’），装入保鲜袋带回实验室。发病叶片保湿活体培养24 h，用4℃蒸馏水洗下病菌孢子囊，配成悬浮液（孢子囊浓度控制为1×106个／mL），4℃下存放备用。未发病叶片在叶脉间用打孔器制成直径1 c m的叶盘，分别置于含有不同处理的药液中浸泡1 min，然后叶背面朝上分别摆放于与浸泡叶盘相同浓度药液润湿的吸水纸上，将配制好的孢子囊悬浮液10μL接种于叶盘中央。每处理1个培养皿，每培养皿20个叶盘，重复4次。置于光暗12 h交替，22℃下培养，7 d后观察结果。根据病斑面积占叶盘面积的百分比划分病级：0级，无病斑；1级，1%～20%；2级，21%～50%；3级，＞50%。计算病情指数和抑制率。

1．3 B－FS01可湿性粉剂制备

参考韦松等方法［17］，先将B－FS01牛肉膏蛋白胨发酵液（菌体含量2．6×109个／mL）与分散剂木质素磺酸钠（6%），润湿剂十二烷基磺酸钠（4%）、稳定剂磷酸氢二钾（4%）混合均匀，再与填料白炭黑按质量比7∶3比例吸附混合，自然晾干后经气流粉碎（细度：98%以上＜0．043 mm）制得枯草芽胞杆菌B－FS01可湿性粉剂（活菌体数不少于109个／g）。

1．4 B－FS01可湿性粉剂田间药效试验

试验选在江苏省南京市江心洲精品果园内进行，品种为‘红宝石’（感病品种），常规栽培措施管理。试验按农业部药检所田间试验准则设计［18］，共5个处理：B－FS01可湿性粉剂用清水稀释成菌体含量105、106、107个／mL，72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂600倍稀释液，清水对照。采用喷雾法施药，在下午16：00后进行，避开高温时间。每处理10株，4次重复，随机区组设计。每小区随机调查10个当年抽生新蔓，自上而下调查10片叶，记录各级病叶数。叶片分级标准：0级，无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5%以下；3级：病斑面积占整个叶面积的6%～25%；5级：病斑面积占整个叶面积的26%～50%；7级：病斑面积占整个叶面积的51%～75%；9级：病斑面积占整个叶面积的75%以上。保护作用：在田间有零星发病时开始施药（试验植株无发病叶片）。2010年7月6日第1次施药；7月13日第2次施药；7月20日第3次施药；7月27日调查药后病指。治疗作用：在田间普遍开始发病时施药，7月13日药前调查病指，第1次施药；7月20日第2次施药；7月27日第3次施药；8月3日调查药后病指。试验期间平均温度28℃，降水量280 mm。

1．5 计算方法

病情指数＝（∑（各级病叶数×相对级数值）／（调查总叶数×级数最高值））×100；抑制率／防效（%）＝［1－（对照区药前病指×处理区药后病指）／（对照区药后病指×处理区药前病指）］×100或＝［（对照区病指－处理区病指）／对照区病指］×100。差异显著性比较采用邓肯氏新复极差法（DMRT）检验（p＜0．05）［18］。

2 结果与分析

2．1 B－FS01及其无菌滤液对葡萄霜霉病菌的室内抑制活性

从表1中可看出，B－FS01发酵液菌体含量为2．6×107个／mL对葡萄霜霉病菌抑制率达到了82．48%，与对照药剂72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂600倍稀释液（83．41%）相当，显著优于其他处理；B－FS01无菌滤液的抑制率（68．88%）与B－FS01发酵液菌体含量2．6×106个／mL的抑制率（73．27%）无显著差异；B－FS01发酵液菌体含量2．6×105个／mL的抑制率（57．59%）最低，显著低于其他处理。

表1 B－FS01对葡萄霜霉病菌室内抑制活性1）

2．2 B－FS01可湿性粉剂各项物理及化学性能

用血球计数板计数，随机取样重复5次，取菌体平均值109个／g为有效菌体浓度；细度98%以上，粒径小于0．043 mm；润湿时间2 min42 s；悬浮率76．5%；含水量3．1%；p H5．8～6．9。以上各项可湿性粉剂物理性能测定方法参照中国农业标准汇编［19］。

2．3 B－FS01可湿性粉剂对葡萄霜霉病田间药效

从表2中可看出，3次药后防效，B－FS01可湿性粉剂稀释液菌体含量107个／mL无论在保护作用还是治疗作用中均表现出对葡萄霜霉病的优良防效，分别为88．25%和80．88%，与对照药剂72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂600倍稀释液无显著性差异，且在保护作用中防效明显优于72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂600倍液，也优于自身在治疗作用中的防效。B－FS01可湿粉剂稀释液菌体含量106个／mL在保护作用中的防效为75．94%，与对照药剂72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂600倍液无显著性差异，但在治疗作用中效果较差，为63．21%；B－FS01可湿性粉剂稀释液菌体含量105个／mL在保护作用和治疗作用中防效均显著低于对照药剂72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂600倍液和B－FS01可湿性粉剂菌体含量106、107个菌体／mL的防效，分别为61．52%和51．27%。试验未发现B－FS01可湿性粉剂稀释液对植株和果实有不良影响。

表2 B－FS01可湿性粉剂对葡萄霜霉病田间药效

3 讨论

芽胞杆菌作为生防菌已有大量的研究报道，但用于防治作物霜霉病的研究较少，能够开发成制剂在田间实际应用并有较好稳定防效的则更是鲜有报道。本试验室筛选到的拮抗菌B－FS01无论在室内还是在田间，对葡萄霜霉病均具有优良的防效，已初步开发成了制剂，正在准备农药登记方面的工作。

霜霉病是田间比较难防治的一种病害，B－FS01对葡萄霜霉病防效较好的原因可能是：首先B－FS01可产生广谱的脂肽类抗生素surfactins和fengycins（包括fengycins A、fengycins B和一种新型的fengycins），它们能够对生物膜产生类似除垢剂的作用［20－22］。这些脂肽类抗生素分子量一般在2 ku以下，可透过细菌过滤器，所以B－FS01无菌滤液同样具有很好的抑菌活性，但显然在实际应用中直接使用B－FS01抗菌物质是不经济且不一定有好的效果的办法，而使用活菌制剂则是相对可行的方法。利用芽胞杆菌本身抗逆特性，可以保证菌体长时间在田间复杂环境下存活，同时也能持续分泌广谱抗菌物质，对植株上的其他病原菌可能起到抑制作用，达到稳定有效防治病害的目的。

其次B－FS01在植株叶片上的“生态占位”作用：B－FS01先于病菌在叶面上定殖，优先取得空间、营养等，从而抑制病原菌的发展，所以在室内试验中采用先药剂处理后接孢子囊的方法，在田间试验结果中也可以看出保护作用要明显好于治疗作用。本次试验期间田间气候不是很利于霜霉病的发生，下一步还应明确在气候适宜、病害严重发生的情况下（如保护地内）B－FS01对霜霉病的防效。

细菌发酵液在储存使用过程中存在很多问题，如二次发酵，生长后期菌体衰老，抑菌活性降低，不利运输，使用不便等。作者对B－FS01发酵液进行了初步剂型开发，各项指标基本达到了可湿性粉剂的工业指标，但在以后的工厂化生产中还应考虑原料的成本问题。

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