胆汁中端粒酶逆转录酶和Bcl-2基因的表达及意义

夏 伟,柳 咏

(江苏省扬州市第一人民医院肝胆外科,江苏扬州,225000)

胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,目前外科手术及放化疗的疗效均欠佳,根治术后5年生存率仅0～30%[1],对其病因及早期诊断治疗的研究逐渐成为热点,有研究表明[2],氧化损伤、癌基因激活和减弱的细胞凋亡在发病中起作用。端粒酶可阻止端粒缩短,进而阻止细胞凋亡,与恶性肿瘤的发生密切相关,Bcl-2是一种有抑制细胞凋亡的癌基因,也与恶性肿瘤的发生密切相关。本实验意欲研究:①胆汁中端粒酶逆转录酶及Bcl-2基因的表达,明确其在胆管癌的早期诊断中的意义,并对2者的诊断意义加〗以比较;②探讨端粒酶逆转录酶和Bcl-2基因在造成胆管癌发生发展中的关系,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

40例胆汁标本取自于本院2008年2月～2010年9月胆管癌及胆总管结石住院患者。胆总管结石胆汁标本20例取自20例胆总管结石患者,在行ERCP取石过程中通过内镜取得;胆管癌胆汁标本20例取自20例胆管癌患者,在行ER2 CP支架置入术中通过内镜取得。胆管癌患者中肝门部胆管癌13例,胆总管中下段癌7例;10例获得手术的胆管癌患者中,按国际抗癌协会UICC标准分期:Ⅰ期0例,Ⅱ期4例,Ⅲ期5例,Ⅳ期1例,Ⅴ期0例。20例胆总管结石患者胆汁标本作为对照组,20例胆管癌患者胆汁标本作为试验组,2组患者一般资料差异无统计学意义,具有可比性。

图1 hTERT基因扩增后电泳结果图(263bp长度为hTERT基因。327bp长度为内对照,标尺为DL2000)

图2 Bcl-2基因扩增后电泳结果图(176bp长度为Bcl-2基因。327bp长度为内对照,标尺为DL2000)

1.2 研究方法

首先提取胆汁标本中的总RNA(总RNA抽提试剂盒,华美生物工程有限公司),用逆转录试剂盒(ImPom-ⅡTM,Promega公司)合成cD2 NA,然后进行聚合酶链式反应(PCR),所用Bcl-2扩增引物:上游引物:5′-GCATCTTCTC2 CTCGCAGCCC-3′,下游引物:5′-CACCAC2 CGTGGCAAAGCGTC-3′。所用端粒酶hTERT扩增引物:上游引物:5′-ACGGCGACATGGA2 GAACAA-3′,下游引物:5′-CACTGTCTTC2 CGCAAGTTCAC-3′。内对照β-actin引物:上游引物:5′-GATGGCCAGGTCATCACCATTG GC-3′,下游引物:5′-GAAGGTGGACAGT2 GAGGCCAGGAT-3′。扩增引物由上海捷倍思生物工程技术服务有限公司合成。最后将目的基因扩增产物进行电泳并进行半定量分析。

2 结 果

2.1 胆管癌患者胆汁中hTERT与Bcl-2基因的扩增电泳结果

胆管癌患者胆汁hTERT与Bcl-2基因扩增结果见图1、图2。

2.2 hTERT与Bcl-2基因的表达结果

以电泳后出现目的基因电泳条带为阳性标准。胆管癌患者胆汁中的hTERT基因阳性(14/ 20),基因相对水平(0.326±0.185),而胆总管结石患者胆汁中hTERT基因无阳性表达,基因相对水平为(0.021±0.014),2组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。胆管癌患者胆汁中Bcl-2基因的阳性率(11/20),基因相对水平(0.284± 0.156),胆总管结石患者胆汁中Bcl-2基因的阳性(1/20),基因表达相对水平为(0.027±0. 019),2组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 端粒酶、Bcl-2在胆管癌和胆管良性病变中胆汁中的表达(n)

2.3 hTERT与Bcl-2基因的相关性

在20例胆管癌患者胆汁标本中,端粒酶与Bcl-2的关系见表2。14例表达hTERT基因阳性的胆管癌胆汁中,Bcl-2基因同时有阳性表达的有9例,6例hTERT基因阴性的胆汁中Bcl-2基因也为阴性的有4例,2者之间无相关性。

3 讨 论

端粒酶激活,端粒延长是大多数肿瘤发生的共同事件,已被公认为肿瘤发生发展的机制之一。研究发现,端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶活性高低的限速决定因子,只有hTERT的表达与端粒酶活性密切相关,近来陆续有报道[3-5]采用RT-PCR方法对人体某些恶性肿瘤包括头颈部癌、肝癌、泌尿上皮癌、肠癌及乳腺癌等标本进行hTERT基因表达检测,结果均显示肿瘤组织的hTERT基因表达量均显著高于正常组织和良性病变组织。本实验采用胆汁标本检测端粒酶逆转录酶基因表达,结果表明胆管癌基因高表达,表达阳性率70%,胆总管结石患者胆汁hTERT无表达,本实验是检测通过无创手段所采集的胆汁,结果如上,胆管癌患者胆汁中hTERT基因的表达高达(14/20),而胆总管结石患者胆汁中无hTERT基因表达,差异显著,说明对于胆管狭窄性质不明通过检测胆汁中hTERT基因的表达可对定性判断提供帮助。况且通过内镜收取胆汁是无创手段,并可同时对需要减黄者做内外引流处理,证实通过RT-PCR方法检测胆汁中hTERT基因可成为诊断胆管癌的一种可取的方式,可作为影像学检查和活检等的补充手段,进一步提高胆管癌的诊断水平。

国内资料显示[6],Bcl-2基因在乳腺癌中的表达显著高于正常乳腺组织。关于Bcl-2于胆管癌的关系也逐渐被认识。细胞凋亡障碍(尤其是Bcl-2凋亡途径异常)在胆管癌发生和发展中的作用已开始受到关注,国外学者对肝胆及其肿瘤Bcl-2表达的免疫组化研究显示[7],肝内胆小管和小胆管上皮Bcl-2蛋白表达阳性,肝细胞、肝内大肝管及肝外胆道均为阴性,72.7%(8/11)的胆管癌表达阳性,肝转移性腺癌阳性率为42. 8%(6/14)。15例肝细胞癌均为阴性,提出胆管细胞是肝胆祖细胞、Bcl-2蛋白表达是胆管癌的特征性标志。本试验通过检测到胆管癌患者胆汁中Bcl-2基因阳性表达(11/20),显著高于胆总管结石组(1/20),说明Bcl-2的过度表达可能在胆管癌的发生中起一定作用。本实验通过无创手段所采集的胆汁,胆管癌患者胆汁中Bcl-2的表达高于胆总管结石者,差异显著,说明对胆管狭窄无法明确性质的患者,通过检测胆汁中Bcl-2可对定性诊断提供一定帮助。

由上可知,端粒酶通过阻止端粒缩短进而阻止细胞凋亡,从而于恶性肿瘤密切相关,Bcl-2通过多种途径抑制细胞凋亡,也与恶性肿瘤密切相关,但在肿瘤的发生过程中两者的相互关系如何,文献少有报道。有研究认为[8],单纯Bcl-2的过度表达可激活端粒酶。胆管癌的发生发展中2者的关系如何尚未见报道。本试验通过对每份胆管癌患者胆汁同时检测hTERT基因和Bcl-2基因,以寻求两者间的关系,结果显示两者无明显相关的关系,其他肿瘤相关基因的作用还待进一步研究。

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