氟对雄性小鼠生殖毒性的试验

吴培福,曲伟杰,郭爱伟

(1.西南林业大学保护生物学学院,云南昆明 650224;2.云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201)

氟是动物生长所必需的元素,适量的氟有利于机体预防龋齿、维持钙磷代谢和保持神经冲动传导,但摄入过量的氟可导致机体中毒,引起人和动物机体多系统功能损害,主要表现为氟骨症和氟斑牙,并对人和动物的健康及经济带来了巨大的损害。长期以来,氟中毒的研究主要集中于氟对骨骼、牙齿等骨相组织的损伤,而对非骨相组织的研究很少见到。近年来,随着氟化物在工农业生产中应用和对氟中毒病的研究,氟对非骨相组织的毒性作用逐渐被人们重视[1]。本试验采用石蜡组织切片技术、细胞计数等方法,系统地探讨了氟对雄性小鼠生殖毒性的作用,为氟致非骨相组织损害的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用昆明系小鼠和鼠粮均购自昆明医学院实验动物中心;制作切片所用的甲醛溶液(分析纯)、丙酮(分析纯)、酒精、二甲苯(分析纯)、软蜡和硬蜡均来自本院重点实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠氟中毒模型的建立 选用20只雄性昆明系小鼠,随机分为4组,分别饲喂含0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和150mg/L氟化钠的饮水120 d(用蒸馏水配制)。鼠粮购自昆明医学院实验动物中心。根据小鼠牙齿损伤的程度来判断氟中毒情况。饲喂结束后,处死小鼠并观察内脏器官的组织病变。1.2.2 睾丸组织切片的制作 参考常规石蜡组织切片流程进行组织切片,即取材、固定、洗涤和脱水、透明 、浸蜡 、包埋 、切片与粘片 、脱蜡 、H.E.染色 、透明和封片观察。

1.2.3 小鼠精子计数和染色观察 在试验的第120天,拉颈处死实验小鼠,用眼科剪解剖阴囊,取出小鼠睾丸,摘取附睾,在烧杯中剪碎,用100 m L PBS冲洗,然后取上清在细胞计数板上进行常规计数。此外,将新鲜采集的精子立即涂片,空气干燥,然后进行H.E.染色,显微镜观察,随机计数200个精子,观察畸形的精子,并计算畸形精子的比率。

1.2.4 氟中毒致小鼠睾丸细胞凋亡的观察 用吖叮橙染液对睾丸组织细胞进行染色,水洗,而后在荧光显微镜下观察凋亡情况。

1.2.5 氟对小鼠睾丸细胞染色体损伤的研究 同上摘取小鼠睾丸,将其剪碎,加入0.9%生理盐水5 m L,再加入蒸馏水5 m L,用胶头滴管吹打均匀,静置20 m in,取上清液与冰乙酸和无水乙醇(1∶3)的混合液等量混合,取混合液滴在洁净的载玻片上,将载玻片在酒精灯上过火1～2次,用姬姆萨染色30 min,水洗,镜检。

2 结果与分析

2.1 小鼠氟中毒模型的建立 经过120 d的饲喂,染氟组小鼠出现不同程度的精神委靡、活动减少等中毒情况,牙齿出现明显的氟斑牙症状,表现为大部分牙釉质脱落,牙本质明显,牙齿表面粗燥、无光泽、透明度差,牙体散在白色斑点或小斑块,且凹凸不平,有缺损。其中150 mg/L染氟组牙齿的病变最为明显。氟对牙齿的损害存在剂量效应关系,随染氟量的增加,牙齿的损伤程度越明显。对照组小鼠牙齿呈正常表现,牙釉质呈棕黄色半透明,牙表面光滑而富有光泽。此外,染氟组小鼠还表现为:胃黏膜和肝脏周缘有出血点,部分小鼠的肾脏肿大。由以上病变情况可以看出,本试验成功建立了小鼠氟中毒的模型。

2.2 氟对小鼠睾丸指数的影响 本试验测定表明,投氟组睾丸指数低于对照组,但氟中毒对睾丸指数没有明显的影响。

2.3 氟对小鼠睾丸组织形态结构的影响 在显微镜下,染氟组小鼠的曲细精管出现管壁断裂,结构排列紊乱,生精细胞、次级精母细胞从生精上皮脱落,部分细胞的胞膜破裂。次级精母细胞、精母细胞和生精上皮细胞的核发生固缩,出现凋亡。曲细精管中精子的数量明显没有对照组多,且精子相互粘连,交连在一起。氟中毒组发育中的精子细胞出现畸形,形态多样,且部分精子细胞膜出现破裂。畸形精子具体表现为蜷曲、断裂、钩尾等病变。此外,染氟组大量次级精母细胞胞质和胞核中出现空泡样病变,且有微核出现(见图 1～3)。

睾丸组织结构的病变程度随着染氟剂量的增加而加重,其中150 mg/L染氟组睾丸的病变最为明显。另外,随染氟量的增加,微核率也相应地增加。

2.4 小鼠精子计数和染色观察 通过细胞计数,发现氟对小鼠精子有一定的损伤作用,由表1可以看出,随着氟中毒剂量的增加,精子数量明显下降。对照组与氟中毒组有显著的差异(P＜0.05)。

图3 150 mg/L氟中毒组脱落细胞的微核率增加(100×)

表1 氟对小鼠精子数量的影响

在显微镜下,对照组精子形态结构完整,而氟中毒组中精子出现蜷曲、钩尾、双头、小头、断裂、顶体脱落、粘连等畸形(图 4、图5)。

2.5 氟中毒致小鼠睾丸细胞凋亡的观察 在荧光显微镜下,对照组细胞正常,而中毒组出现凋亡样细胞,细胞固缩,有明亮的荧光点,其中100 mg/L中毒组最为明显。150 mg/L氟中毒组中细胞的凋亡量小于100 mg/L中毒组,但出现了大量的死亡细胞,表现为胞核荧光散大。

2.6 氟对小鼠睾丸细胞染色体损伤的研究 对照组细胞的染色体没有任何异常现象,氟中毒组细胞的染色体出现环形、交换异常等现象。

3 讨论

3.1 氟中毒模型的建立 氟中毒一般呈地方流行性,且饮水型氟中毒常呈慢性中毒。本试验采用给动物投服高氟水的途径给氟,简单易行,符合饮水型氟中毒的摄氟途径。通过试验分析结果可以看出,给小鼠饲喂高浓度的含氟水3个月,便可引起明显的氟中毒,这与以往的报道相一致。氟中毒模型建立所需时间的长短与投氟的途径、氟化物的浓度、采用的试验动物等有关。如高剂量的氟引起中毒的时间短,不同的动物对氟的耐受性不一样。

3.2 氟对小鼠睾丸指数的影响 本试验显示氟中毒对器官发育上的影响不大,这与以往的研究结果相一致,但王建[2]对鸡的研究结果表明,染氟鸡体质量、睾丸质量、睾丸质量/体质量均显著低于对照组,与本试验不一致。这可能与以下原因有关:染氟剂量不一样;不同的剂量对组织器官的损伤程度不一样;投氟时间长短不一样;动物品种不一样;不同动物品种对氟的耐受量不一样。

3.3 氟对小鼠睾丸组织形态结构的影响 睾丸组织主要由生殖细胞、支持细胞和间质细胞组成。睾丸的结构与功能是否正常将会影响精子的质和量。本试验结果显示,染氟组睾丸曲细精管结构排列紊乱,生精细胞、次级精母细胞发生脱落,精母细胞胞质和胞核中出现大量的空泡样病变,细胞的微核率增加,精子出现畸形。Kour研究表明,氟可使小鼠曲精小管退化坏死,精子发育停止[9]。宁可钦和甄炯[3-4]等研究发现,高氟对睾丸组织支持细胞、精子细胞和间质细胞损伤明显。崔留欣等[5]研究表明,氟致各级生精细胞损伤中,以精子细胞为主。该研究结果的差异,可能与染氟剂量、投氟时间长短、动物品种等有关。

精子的形成与睾丸组织结构的完整性有直接的关系。氟中毒时,睾丸的组织结构受到不同程度的损伤,这不难解释染氟组精子数量少的原因。此外,氟是一种很活泼的元素,对精原细胞、精子等可能有直接的作用,因而,出现各种畸形和相互的粘连。

3.4 小鼠精子计数和染色观察 精子数量、形态和活动率是分析雄性生殖功能的重要指标之一。唐前华等[6]研究表明,随着尿氟逐渐升高,精子数量、精子活动率均较明显递减,精子活动力也明显减弱。本试验研究结果显示染氟后,氟组大鼠精子计数、精子活动率均显著低于对照组,精子畸形率显著高于对照组,与以往的试验结果相一致。

3.5 氟中毒致小鼠睾丸细胞凋亡的观察 有关氟致小鼠睾丸细胞凋亡的报道很少,本试验表明,氟可引发睾丸细胞的凋亡,且100mg/L时最为明显。氟引发睾丸细胞凋亡的机理可能与以下因素有关:诱导自由基产生而导致脂质过氧化作用增强;与生殖系统中组织器官细胞膜受损离子通道改变有关;作为酶抑制剂抑制相关酶活性,尤其是二价金属离子为辅基的酶。

3.6 氟对小鼠睾丸细胞染色体损伤的研究 有关氟的遗传毒性方面,目前仍有争议[7-8]。梁玉华等研究表明,高氟可引起染色体断裂,导致染色体畸变。Tsutsui曾观察到氟化物可引起培养的叙利亚地鼠胚胎细胞新生物的形态转化,胚胎细胞的染色体畸变率、姐妹染色单体互换率及程序DNA合成明显增加[8]。这些研究结果与本试验一致。氟化物到底是否具有遗传毒性,还需进一步的研究。

[1] 徐海峰,牛广明,陈克,等.过量摄入氟化物对多器官损伤的研究[J].内蒙古医学杂志,2009,41(4):385-388.

[2] 黎晓敏,秦港,王建.实验性氟中毒鸡睾丸组织的病理学研究[J].畜牧兽医学报,2006,37(7):717-721.

[3] 宁可钦,袁淑德,刘伟,等.慢性氟中毒大鼠睾丸和前列腺的超微结构观察[J].中国医科大学学报,1990,19(5):3393-3420.

[4] 甄炯,陈荣安,章孟本,等.氟化钠对雄性大鼠生殖系统影响的实验研究[J].工业卫生与职业病,1993,19(4):202-207.

[5] 崔留欣,姜春霞,王锡林,等.氟致雄性大鼠生殖功能损害的实验研究[J].中国地方病学杂志,2003,22(3):195-197.

[6] 唐前华,孙发.燃煤型氟中毒对人体精子活力的影响[J].医药与保健,2009,17(8):84-85.

[7] 张平.氟化物遗传毒性的研究进展[J].畜禽业,2009,238:42-44.

[8] 周健.氟的生殖、遗传毒性和对子代健康影响的研究进展[J].现代预防医学,2008,35(14):2640-2643.