特戊酸柠檬酯对植物病原真菌的抑菌活性

关晔晴，陈红兵，刘慧平，韩巨才

（1.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学文理学院，山西 太谷 030801）

基于环境和谐农药这一理念的不断发展，从微生物代谢产物中寻找发现新型先导化合物，是生物农药研制的一个重要方向[1-4]。放线菌是一类重要的微生物资源，目前，大约有超过2/3的抗生素类物质来自于放线菌的次生代谢物质[5-7]，如井冈霉素、春雷霉素、多效霉素、农抗120、中生菌素等在植物病害防治上已被广泛应用[8-9]。特戊酸柠檬酯（Neryl pivalate）是在前期研究1株辣椒内生娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）代谢产物的抑菌活性试验中合成的一种化合物[10]。特戊酸酯类具有抗水解性和特定芳香气味，作为工业香料，可用作香皂、洗发水、发胶等香味添加剂，在医药工业中，用于制造若干缓释类药剂[11-12]。目前，国内外对其抗真菌活性方面还未见有报道。

本试验以特戊酸柠檬酯为研究对象，测定了其对6种常见植物病原真菌的抑制作用，并分析了对病菌菌丝、孢子形态的影响，为进一步研究其作用机制，将其开发成为生物农药新品种提供试验基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，水1000 mL。

1.1.2 供试病原菌 番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、梨黑斑病菌（Alternaria alternata）、小麦叶枯病菌（Alternaria triticina），均由山西农业大学农药学实验室提供。

1.1.3 供试药剂 特戊酸柠檬酯（山西农业大学农药化学实验室合成）、丙酮（天津市化学试剂六厂生产）、Tween80（天津市北辰方正试剂厂生产）、50%多菌灵可湿性粉剂（海南江河农药化工有限公司生产）、75%甲基托布津可湿性粉剂（日本曹达株式会生产）。

1.2 试验方法

1.2.1 特戊酸柠檬酯对6种病原菌菌丝抑制作用的测定 采用FAO推荐的菌落直径法[13]。将特戊酸柠檬酯用体积分数为50%的丙酮溶液溶解，用无菌水分别稀释为 112，224，336，448，896 mg/L，再将各药液分别与PDA培养基按1∶9的比例混合制备含药平板。在各平板上分别接入直径5 mm的供试6种病原菌新鲜菌块，在25℃条件下培养5 d后，测定不同质量浓度下各处理的菌落直径。3次重复，以含体积分数为50%的丙酮为对照。用DPS 6.0软件分析毒力回归方程式、EC50值和95%置信限。

1.2.2 特戊酸柠檬酯对6种病原菌孢子抑制作用的测定 其测定采用悬滴法[14]。制备孢子悬浮液，将特戊酸柠檬酯配制的 31.25，62.5，125，250，500mg/L药液分别与等体积的孢子悬浮液混合，保湿培养，于12，24 h后在光学显微镜下观察孢子的萌发情况，以芽管长度超过孢子直径1/2计为萌发。5次重复，以无菌水为对照。

1.2.3 特戊酸柠檬酯与2种杀菌剂毒力差异的测定 分别将50%多菌灵可湿性粉剂、75%甲基托布津可湿性粉剂制成10000mg/L的母液，再根据预试验结果将各药剂分别用无菌水稀释为5个不同的梯度，将各药液分别与PDA培养基按1∶9混合制备含药平板。在平板上分别接入直径为5 mm的番茄早疫病菌和梨黑斑病菌新鲜菌块，25℃恒温培养5 d后，测定不同梯度下各处理的菌落直径。3次重复，以无菌水为对照。

1.2.4 特戊酸柠檬酯对病原菌菌丝、孢子形态的影响 挑取6种新鲜病原菌菌丝分别与250mg/L特戊酸柠檬酯药液混合，于凹玻片中25℃保湿培养。在12，24，48 h时镜检（400×）孢子萌发及菌丝生长情况。以无菌水为对照。

2 结果与分析

2.1 特戊酸柠檬酯对6种病原菌菌丝生长影响

由表1可知，特戊酸柠檬酯对6种病原菌菌丝的生长均有一定的抑制作用，其EC50在338.72～829.20mg/L之间，其中对辣椒枯萎病菌的抑制作用最强，EC50为338.72 mg/L；其次为小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌，其EC50分别为406.01，426.61 mg/L；对其余3种链格孢属病原菌菌丝生长的抑制作用较弱，EC50在678.05～829.20mg/L之间。这表明特戊酸柠檬酯对不同病原菌的抑菌活性存在较大差异，但抗菌谱较广。

表1 特戊酸柠檬酯对6种病原菌菌丝生长的影响

2.2 特戊酸柠檬酯对6种病原菌孢子萌发影响

从表2可以看出，特戊酸柠檬酯可不同程度抑制6种病原菌的孢子萌发，对番茄早疫病菌的抑制作用最强，EC50为59.63 mg/L；对番茄灰霉病菌、梨黑斑病菌、小麦赤霉病菌和辣椒枯萎病菌的作用次之，EC50分别为 87.89，91.56，108.62，115.57 mg/L；对小麦叶枯病菌孢子萌发的抑制作用最弱，EC50为131.69 mg/L。表明特戊酸柠檬酯对病原菌孢子萌发的抑制作用强于对病原菌菌丝，但其大小与对菌丝生长的抑制规律有所不同。

表2 特戊酸柠檬酯对6种病原菌孢子萌发的影响

2.3 特戊酸柠檬酯与2种杀菌剂的毒力差异比较结果

从表3可以看出，特戊酸柠檬酯抑制番茄早疫病菌和梨黑斑病菌菌丝生长的EC50分别为678.05，760.83 mg/L；甲基托布津对2种病菌的EC50分别为58.89，47.04 mg/L；多菌灵对2种病菌的EC50分别为643.38，1208 .87 mg/L；与甲基托布津相比，特戊酸柠檬酯对2种病菌的EC50较高；而与多菌灵相比，特戊酸柠檬酯对番茄早疫病菌的EC50接近于多菌灵，但对梨黑斑病菌的EC50明显小于多菌灵，且存在显著性差异。说明特戊酸柠檬酯对梨黑斑病菌的抑菌效果优于广谱性杀菌剂多菌灵，有进一步开发为农药的应用价值。

表3 特戊酸柠檬酯与2种杀菌剂的毒力差异比较

2.4 特戊酸柠檬酯对病原菌菌丝、孢子形态的影响

研究结果（图1）表明，经特戊酸柠檬酯处理的病原菌菌丝（以小麦叶枯病菌为例）扭曲变形，部分菌丝断裂，菌丝隔膜不明显，原生质浓缩；经特戊酸柠檬酯处理的病原菌孢子不能正常萌发，部分畸形，出现疱疹样突起（图1-A）。而对照组菌丝体正常发育，隔膜明显，原生质分布合理；病菌孢子正常发育萌发，12 h后即可产生菌丝（图1-B）。

3 结论与讨论

经试验得出，特戊酸柠檬酯对辣椒枯萎病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌、小麦叶枯病菌菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用，且对孢子萌发的抑制作用普遍强于对菌丝生长，其中，对番茄早疫病菌的孢子萌发抑制作用最强，EC50为59.63 mg/L。试验进一步观察了该物质对病原菌菌丝和孢子形态的影响，结果表明，经特戊酸柠檬酯处理的菌丝和孢子形态发生了较为明显的变化，造成菌丝体断裂扭曲，原生质浓缩，孢子部分畸形。

特戊酸柠檬酯是在前期研究1株辣椒内生放线菌代谢抑菌产物中分离合成得到的化合物。马林等[15]报道了此株辣椒内生放线菌发酵液对多种病原真菌有抑制作用。徐光伟等[16]研究报道，特戊酸柠檬酯是药对桂枝-荆芥与其单味药挥发油共有的组分，桂枝、荆芥均为中医临床常用解表药。Liang等[17-18]研究发现，胡椒精油中的主要化学成分有特戊酸异柠檬酯，胡椒作为一种香料植物，具有防腐、驱风、抗氧化、抗菌等作用。特戊酸柠檬酯和特戊酸异柠檬酯化学结构非常接近，都是来源于生物体，与环境有很好的相容性，不易使病原菌产生抗药性，因此，具有一定的开发价值。本试验只研究了特戊酸柠檬酯对病原菌的抑制作用及对菌丝和孢子形态的影响，对其作用机制及其他方面的测定还有待进一步研究。

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