奶牛miRNA的研究进展

田青

（江苏食品职业技术学院 食品与营养工程学院，江苏 淮安 223003）

奶牛miRNA的研究进展

田青

（江苏食品职业技术学院 食品与营养工程学院，江苏 淮安 223003）

综述了奶牛miRNA的鉴定方法、miRNA与奶牛疾病的关系以及miRNA与奶牛乳腺发育和乳汁分泌的关系，旨在为以后miRNA在奶牛上的深入研究奠定理论基础。

奶牛；miRNA；疾病；应激；乳腺

0 引 言

miRNA即微小RNA，又称microRNA，是一类内源性的长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA，能够在转录后水平调节mRNA表达。目前，人们已经从miRNA的发现、简单作用机制、生物学特性、与恶性肿瘤等疾病的关系即免疫等方面进行了研究[1]。

miRNA首先是由Lee RC等1993年在秀丽新小杆线虫（c.elegans）中意外发现的，直到现在，已经在很多物种尤其在哺乳动物鼠类中有了较深入的研究；李娜、朱文奇、薛西等很多研究人员分别于近几年对miRNA的作用机制、生物学特性和其与免疫的关系等方面做了深入的研究[2,3,4]。

以上的研究虽然相对比较全面，但是目前的研究对于哺乳动物而言主要限定在大鼠、小鼠和人上，对于牛尤其是奶牛方面的研究并不多，本文就miRNA在牛方面的研究工作做一概述，为以后的研究提供依据。

1 奶牛miRNA的鉴定方法

1.1 基因克隆法

Zhiliang Gu等[5]通过克隆牛脂肪组织和乳腺组织小的RNA确定了59个不同的miRNAs，其中5个和已知的哺乳动物的miRNAs是不同源的，绝大多数有30和（或）50个末端变异体。核糖核酸酶保护试验表明miR-23a和miR-24基因紧密位于同一染色体上，在不同组织上共同表达。试验还发现几个乳腺中miRNAs的作用和以前所报道的骨骼和心肌特有的miRNA—miR-133的作用，它对于反刍动物瘤胃具有器官特异性。

1.2 实验室生物学鉴定法

Taketoshi等[6]2010年通过离心和超速离心的方法可以从牛奶中获得直径大约100 nm的超微小泡，超微小泡中大约1 700和1 000 ng总RNA，其主要成分是小RNA，不管RNA酶活性，超微小泡中各自包含有大概6 mL的初乳和常乳。存在于超微小泡中的聚腺苷酸基因转录主要牛奶蛋白质和翻译延长因子-1a（EF-1a），通过实时定量PCR锁定mRNA 50和30末端和体外翻译分析确定了一些完整的转录。此外，相当多的乳腺和免疫相关microRNAs存在于来自牛奶的超微小泡中，牛奶酸化模仿胃肠道对RNA的产量和质量影响不大。用源自牛奶的超微小泡培养细胞研究牛奶相关基因转录，发现细胞摄取包含RNA的超微小泡内容物，研究发现牛奶容纳RNA能够被转移至活细胞和涉及到小牛的胃肠道和免疫系统的发育中。

1.3 计算机预测法

miRNAs通过直接断裂靶点miRNAs或抑制翻译在转录后水平调节基因表达，虽然通过克隆、遗传筛选、试验性的方法发现了miRNAs的部分成员，但是由于效率低、费时、成本高等缺点使得这些方法受到了限制，因此，计算机方法便得到了发展。计算机方法用来识别miRNAs主要依靠miRNA以下几个主要特征：发卡二级结构、高度保守性、高度最小折叠的自由能指数（MFEI），在辨别miRNA作用靶点上计算机方法也起着重要作用，一些以网络和非网络为基础的计算机软件公开应用于miRNA及其靶点的预测[7]。

1.4 生物信息学方法

穆松等[8]2010年根据NCBI数据库中的牛EST、GSS信息以及猪、家犬、人、大猩猩和小家鼠5种哺乳动物的已经注册miRNA分子信息，预测牛新的候选miRNA,通过碱基错配、二级结构、A+U含量、自由能大小等分析候选序列特征,得到了17条牛新的候选miRNA，这说明根据miRNA的保守性和物种之间基因组的同源性，用生物信息学理论和方法筛选、寻找新的miRNA候选序列的方法能够在较短时间里寻找出一定量的新miRNA分子,速度快、通量大,是一条行之有效的在生物体内寻找到更多miRNA分子的新思路和途径。

另外，正相遗传分析方法、反相遗传分析方法也分别广泛应用于人、线虫、果蝇等动物的microRNAs鉴定中[3]，不久的将来，这些方法也将大量单独或者结合应用于牛的microRNAs鉴定中。

2 miRNA与奶牛疾病调控

奶牛乳房炎是影响奶牛产奶量和乳品质的主要疾病，因此了解与奶牛乳房炎等疾病相关的microRNAs及其与疾病的关系对于疾病的预防至关重要。从目前的研究发现，很多的miRNA参与到奶牛的疾病调控 中 去 。 这 些miRNA有 ：miR-21，miR-181b-1，miR-125b，miR-218，miR-155，miR-137，miR-182，miR-372等。

Dimitrios等[9]2010研究发现，瞬时的炎症信号能够通过NF-kB,Lin28,let-7和IL-6正反馈循环发起从非转化的到癌细胞遗传开关。笔者确定了对这个开关起重要不同调节作用的microRNAs并且对在激活子上的转录因子结合位点作出了推断。被IL-6活化的转录因子STAT3，可以直接激活miR-21和miR-181b-1。引人注目的是，任何一个microRNA的瞬间表达都引起遗传开关，MiR-21和miR-181b-1都各自抑制PTEN和CYLD肿瘤抑制基因从而导致NF-kB激活去维持这种变化状态。这种由STAT3调节的调控通路需要不同细胞系和肿瘤异种移植生长状态的改变，它们的转录特征在克隆的恶性肿瘤中可以观察到。因此，STAT3不但是IL-6的下游靶点，而且和miR-21,miR-181b-1,PTEN,和CYLD都是正反馈循环的一部分，是联系炎症和癌症的遗传基础。Chan等[10]，2005年发现，miR-21在人类恶性胶质瘤组织中高表达，抑制miR-21的表达后，肿瘤细胞凋亡明显增加，而与凋亡密切相关的胱酰蛋白酶-3和胱酰蛋白酶-7活性增加了3倍。

具有高迁移率的组蛋白HMGA2作为杆细胞染色质的组分和一种与多种良性肿瘤的发展有关蛋白质（如子宫肌瘤、脂肪瘤、唾液腺多形性腺瘤）起着非常重要的作用。因此，HMGA2内含子3中存在高度保守区域编码的一种microRNA，这种与HMGA2的协同表达显示了作为一种内含子microRNA他能够在生理或异常情况下与HMGA2协同表达[11]。

Eis PS等[12]2005年研究发现编码lin-28蛋白的mRNA可能是let-7a，miR-125b和miR-218的靶mRNA。let-7a，miR-125b和miR-218可能通过调节lin-28Mrnade表达控制NT2/D1神经细胞分化和发育；还发现在各种类型的B细胞淋巴瘤组织miR-155的表达较正常组织高10～30倍。

Yu SL等[13]2008年研究发现，miR-137,182,372能促进肺癌细胞的侵袭，miR-221能够抑制细胞的侵袭。

3 miRNA与应激条件下奶牛乳腺发育和乳汁分泌

研究发现，很多的miRNA与奶牛的乳腺发育和乳汁繁密有关，这些miRNA有：miRNA-24，miRNA-143，miRNA-125，miRNA-195，miRNA-21等。

周振峰等[14]研究了热应激对奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及热休克蛋白（Heat Shock Protein,HSP）mRNA转录的影响，结果提示高温抑制乳腺上皮细胞正常生长,促使细胞凋亡,并诱导乳腺上皮细胞HSF-1和HSPs mRNA的转录表达。

李惠侠等[15]年利用体外培养奶牛乳腺上皮细胞，应用miRNA基因沉默等技术研究了高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响，研究发现抑制miRNA-24的表达，高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强（P＜0.05），凋亡细胞数显著减少（P＜0.05），促凋亡因子caspases-8和caspases-3表达量下调。说明内源性miRNA-24对乳腺组织发育具有重要的调控作用，抑制miRNA-24的表达可以缓解高温诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡发生率、促进细胞的生长发育。

万中英等[16]首次用荧光定量RT-PCR检测增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素作用后乳腺上皮细胞miRNAs表达变化，结果表明王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素均抑制原代培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞miRNA-143、miRNA-125和miRNA-195表达;邻苯二甲酸二丁酯可抑制miRNA-21表达。

RNA调节基因沉默路径是一种保守进化过程，他重点强调真核生物基因调控和抗病毒防御的小RNA的基础作用，目前发现了3条不同小RNA控制路径，如通过siRNA破坏mRNA、通过miRNA抑制mRNA翻译和通过siRNA沉默外源基因。在这些路径中，核糖核酸酶III家族成员在不同RNA成熟和衰亡过程中发挥着重要作用。Lihua[17]等2009年发现了RNA调节基因沉默路径依赖与分类学进化。

4 miRNA在奶牛生产中的应用前景

从miRNA的鉴定方法来看，在目前的研究中基本上已经具有较为成熟可靠的方法，但每种方法似乎都有一定缺点，随着科学技术水平的不断提高，相信研究方法必定会有所突破，必定会有更为简单、高效、可靠的方法出现；从miRNA的研究水平来看，目前在牛属中已经鉴定出600多种miRNA，但是绝大多数都是作为乳腺癌的分子标记进行研究，在奶牛常见疾病乳腺炎和奶牛正常生理条件下关于miRNA的研究并不多见，尤其是维持奶牛乳腺健康、调节奶牛乳腺发育和泌乳的功能、改善奶牛乳品质和作用机理方面的研究并不多见。牛奶已经逐渐成为人们生活中必不可少的一部分，尤其是婴幼儿，因此，加强这方面的研究必将成为以后奶牛研究的重点。

[1]邱悦，邱雪杉.miRNA的研究进展[J].中国当代医药，2010,17（19）：14-16.

[2]李娜，肖斌，邹全明.miRNA在细胞因子表达调控中的作用[J].生命的化学，2010,30（4）：514-517.

[3]朱文奇,陈宽维,李慧芳，等.动物miRNA的最新研究进展[J].中国畜牧兽医，2009,36（11）：66-69.

[4]薛茜,杨安钢.miRNA在免疫系统中的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，26（1）：93-95.

[5]ZHILIANG G,SATYANARYANA E,HONGLIN J.Identification and Characterization of microRNAs from the Bovine Adipose Tissue and Mammary Gland[J].FEBS Letters，2007,581：981–988.

[6]TAKETOSHI H,KOSUKE M,HAJIME N.Isolation of Bovine Milk-Derived Microvesicles Carrying mRNAs and microRNAs[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2010,396：528–533.

[7]BAOHONG Z，XIAOPING P,QINGLIAN W.et al.Computational Identification of microRNAs and Their Target[J].Computational Biology and Chemistry，2006,30：395–407.

[8]穆松,钟金城,陈智华，等.牛基因组中新的microRNA预测及分析[J].中国草食动物，2010,30（1）：8-11.

[9]DIMITRIOS I,SAVINA A.JAEGER,H A，et al.STAT3 Activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD Are Part of the Epigenetic Switch Linking Inflammation to Cancer[J].Molecular Cell，2010,39：493–506.

[10]CHAN J A,KRICHEVSKY A M,KOSIK K S.MicroRNA-21 is an Antiapoptotic Factor in Human Glioblastoma Cells[J].Cancer Res,2005,65（14）：6029-6033.

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[12]EIS P S,TAM W,SUN L,et al.Accumulation of miR-155 and BIC RNA in Human B Cell Lymphomas[J].Proc Natl Acad Sci USA.2005,102（10）：3627-3632.

[13]YU S L,CHEN H Y,CHANG G C,et al.microRNA Signature Predicts Sur-vival and Relapse in Hung Cancer[J].Cancer Cell，2008,13（1）：48-57.

[14]周振峰,崔瑞莲,王加启，等.热应激对体外培养奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及其热休克蛋白mRNA转录的影响[J].畜牧兽医学报，2010,41（5）：600-607.

[15]李惠侠，王振云，张震，等，高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响[J]，中国农业科学，2010,43（22）：4732-4738

[16]万中英,佟慧丽,李庆章等.中药王不留行增乳活性单体及催乳素对奶牛乳腺上皮细胞特异性miRNA的影响[J].中国畜牧兽医，2010,37（8）：230-232.

[17]LIHUA J,KIRILL K,YOSHIYUKI S.et al.The Evolutionary Study of Small RNA-directed Gene Silencing Pathways by Investigating RNase III Enzymes[J].Gene，2009,435：1–8.

Research on cow’s miRNAs

TIAN Qing
（Jiangsu Food Science College,Department of Food and Nutrition,Huaian 223003，China）

In this paper,the appraisal methods of cow’s miRNAs,the relationship between miRNAs and cow diseases,and the development cow’s mammary gland and milk secretion were reviewed.The aim to this study is to get theoretical basis for later in-depth study in the cow’s miRNA.

cow；miRNA；disease；stress；mammary gland

S858.23

B

1001-2230（2011）09-0040-03

2011-06-28

国家“973”项目：牛奶重要营养品质形成与调控机理研究（2011 CB100803）。

田青（1980-），女，讲师，研究方向为奶牛营养。