双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用进展

杨玉霞

(南京农业大学农学院，江苏南京210095)

随着人们对基因组的研究越来越深刻和全面，也就认识到单纯孤立地进行核酸研究已不能完全解释生命现象的本质问题，只有将对核酸和蛋白质结合在一起进行研究才能从根本上对生命的本质有全面的认识。随着人类基因组计划的逐步完成和后基因组时代的到来，一个新的研究领域——蛋白质组的研究随之被提出来了。

1 蛋白质组学

蛋白质组(Proteome)，源于蛋白质(protein)与基因(genome)2个词的杂合，是指一种基因组或一种生物、一个细胞(组织)所表达的全套蛋白质。蛋白质组学[1](proteomics)则以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上来研究蛋白质的组成与调控的活动规律。

蛋白质组学研究的主要内容包括2个方面，即蛋白质的表达模式和蛋白质的功能模式。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标，它是要揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深层次了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因的结构与蛋白质的结构和功能的关系。只有在建立了蛋白质相互作用的细胞图谱之后，人们才能开始通过打断蛋白质间相互作用的路径来研究细胞功能。

研究蛋白质组的三大核心技术是双向电泳、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术。而双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是目前唯一可将数千种蛋白质同时分离的方法，双向电泳技术联合质谱鉴定技术被公认为是目前蛋白质组研究技术的标准方法[2]。

2 双向电泳技术

2.1 双向电泳技术原理

双向电泳技术由Farre l等人于1975年建立。其基本原理是:第1向进行等电聚焦，因为蛋白质是两性分子，具有不同的等电点，在pH梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带;第2向根据分子量不同进行分离。第1向等电聚焦完成后，将凝胶包埋在SDS-PAGE凝胶板上端，在垂直或水平方向进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)第2次分离，结果形成分离的蛋白质点[1－2]，所得蛋白质双维图谱中每个点代表样本中的一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来[3]

2.2 双向电泳技术在水稻蛋白质组学中的应用

水稻蛋白质组学的两大重要任务是:1)确定从已经构建的水稻cDNA文库中的cDNA所编码的蛋白质是否能通过在计算机上进行氨基酸序列同源搜索得到证实;2)预测这些蛋白质的功能并研究水稻功能蛋白的生理意义。随着蛋白质组技术体系的不断发展以及水稻基因组与蛋白质组数据库的不断充实，一些适用于水稻蛋白质组的研究体系正日臻完善，越来越多的水稻功能蛋白质已得到证实[4]。

由Komat su等[5]构建的水稻蛋白组文库是关于水稻组织蛋白组分析的先锋报导。水稻种子胚、胚乳以及叶片蛋白，经2D2PA GE分离，考马斯亮蓝染色，在胚、胚乳和叶片中检测到超过600、100和150个主要蛋白。Zhong等[6]分析了水稻根部总蛋白，考马斯亮蓝染色后检测到292个蛋白点。N2端和中间氨基酸测序分析了76个蛋白。经同源搜索鉴定了42个蛋白。同年Hirano通过2D2PA GE技术研究了水稻种子胚、胚乳和叶、根的蛋白，总共分析了278个蛋白，4个组织中的121个蛋白的N2端和中间氨基酸序列已测出。Ramani和Apte[7]用放射性同位素自显影双向电泳法研究水稻幼苗盐胁迫下多基因的瞬时表达表明，至少有35个蛋白质被盐胁迫诱导和17个蛋白质被抑制，包括20个在这之前未曾报道的低丰度蛋白。Agrawal等[8]用2D2PA GE、氨基酸测序和免疫杂交法，首次检测了臭氧对水稻幼苗蛋白的影响。Monowar等[9]通过2D2PA GE分离核蛋白，采用Image2 Master 2D Elite软件分析考马斯亮蓝染色的p H4～10的胶条，有549个蛋白点，挑选出了257个丰度较高蛋白点。

2.3 双向电泳技术的部分优化步骤

判断双向凝胶电泳质量的好坏可通过分析其图谱而获得。一张好的图谱必须背景低、纹理少、分辨率高、灵敏度高，而且图谱必须有良好的重现性。但是由于技术的熟练程度以及技巧掌握的不同，往往凝胶电泳图谱存在一些问题。下面介绍几个关键步骤的优化方案。

2.3.1 蛋白质提取方法的优化

不同的蛋白质提取方法对双向电泳的分离效果影响很大。根据不同的研究目的，应选择不同的蛋白质提取方法。丁承强等[10]研究发现如果要研究组织中尽可能多的蛋白质，可以选择TCA-丙酮法(这一方法是目前应用最广的蛋白质提取方法)。而当研究目的是可溶性蛋白质时，可以使用Tris-HCl缓冲液进行提取。如果研究不同的亚细胞器，则最常使用梯度离心的方法，分别提取不同亚细胞器的蛋白质。如果提取的组织中含有大量的糖类，可以增加乙醇/乙醚的清洗次数，这种方法得到的双向泳图，背景比用丙酮清洗的更加干净。

2.3.2 上样量的优化

对上样量影响最大的因素有2个，即染色方法和IPG胶条。如果采用银染，那么上样量通常在100～300μg;IPG胶条的pH值范围越大，上样量越少。上样量增大，分离的蛋白质点数减少;上样量减小，胶图背景变深。综合比较，选择蛋白质点数多且背景较好的上样量进行双向电泳实验。

2.3.3 聚焦时间的优化

丁承强等[10]发现电泳图中如果蛋白质点的右侧有明显拖尾，左侧没有，则说明聚焦伏小时数过多，聚焦过度，这时应减少聚焦时间;如果蛋白质点的两侧均有明显的拖尾，则说明聚焦伏小时数过少，没有完全聚焦，应增加聚焦时间。

2.4 双向电泳技术的局限性

目前，双向电泳技术检测的蛋白质数目比估计的细胞内总蛋白少得多，主要原因有[3]:电泳的灵敏度不够，一些低拷贝数蛋白检测不到，实验结果表明当蛋白质的拷贝数低于1 000时，双向电泳技术是不能分辨出来的;部分蛋白(如膜蛋白)不溶于样品缓冲液，疏水膜蛋白和大分子蛋白不易进入凝胶的第2向;一些分子量过大、极端酸性或碱性的蛋白在电泳过程中会丢失;有时一个蛋白质点含有不止一种蛋白。

样品处理也是影响双向电泳灵敏度的主要原因之一。双向电泳技术具有极高的分辨率和灵敏度，可以同时显示组织或细胞内各种蛋白，但其重复性却很不理想。

3 展望

蛋白质组研究的技术体系为人类从蛋白质水平上揭开生命活动规律提供了有力的武器。虽然作为蛋白质组研究的核心技术双向电泳技术尚未完善，手工操作较多，经验性强，存在许多局限性。随着科学技术的发展，双向凝胶电泳技术必将日趋完善，影响其发展的瓶颈也会得到最终解决。未来通过双向电泳及其他技术获得水稻全植株的蛋白质组信息以及水稻在正常与病理，可育与不育等条件下所出现的关键的差异蛋白，可帮助人们在蛋白质水平上充分利用水稻基因序列图谱研究成果，更好地利用杂交优势[11]，建立水稻高新栽培技术的标准化模式，最终促进农业持续发展.

[1]皇甫海燕，官春云，郭宝顺，等.蛋白质组学及植物蛋白质组学研究进展[J].作物研究，2006(5):577－581.

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[7]Ramani S，Apte S K.Transient Expression of Multiple Genes in salinity-stressed young seedlings of rice cv.bura rata[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1997，233:663－667.

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