沙门菌载体重组疫苗的研究进展

马延滨,高闪电,丛国正,常惠芸

(中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046)

目前,大多数疫苗都采用皮下或肌肉注射,可以诱导有效的血清免疫,但通常无法诱导黏膜抗体(sIgA)的产生。皮下或肌肉注射导致动物产生较大的应激反应,采食量下降,影响动物生长繁殖。实际生产中的不规范免疫操作可能导致病原微生物在个体间的人为传播而引发疾病。

细菌和病毒在自然宿主体内的传播,导致多种感染性疾病持续存在。这种情况甚至危及到公共安全以及濒危动物的生存[1]。在大多数情况下,通过屠宰的手段控制病原菌在自然宿主之间的传播是不经济的,同时也不会被公众所接受。

针对皮下或肌肉注射的特点,以及野生动物免疫现状。口服疫苗的研制成为当前热点。

口服疫苗是指通过口服,诱导机体产生针对致病原的特异性抗体或细胞免疫,从而使机体获得保护或消灭该病原能力的生物制品。

目前,口服疫苗的研制主要是通过转基因技术将目的抗原基因克隆表达到载体质粒上,然后将其转染到特定的载体系统中表达。一般常用的活载体系统包括细菌载体、病毒载体、植物载体。这里我们将介绍弱毒沙门菌作为载体制备口服疫苗的研究进展。

1 沙门菌载体疫苗的免疫机制

1.1 重组沙门菌穿越肠壁的机制 肠上皮层覆盖有皮尔氏小体(Peyer′s patches,PP),PP表面有特化的上皮M细胞(membranous epithelial cells)[2]。重组沙门菌可以粘附在M细胞上,然后M细胞将沙门菌载体转移到皮尔氏小体中,完成载体疫苗的穿越肠壁过程[3]。

1.2 沙门菌载体疫苗的免疫过程 PP的M细胞下是皮下半球形区域。这个区域有丰富的DCs(树突状细胞),位于半球形区之下的是B细胞囊,它的两边被T细胞填充。当重组沙门菌进入PP时,首先被半球形区中的 DCs所捕获,然后将其呈递给T细胞,诱导PP中的T细胞产生免疫应答或者直接将其呈递到MLN中诱导产生体液免疫[4]。

在重组沙门菌登革热疫苗株SL3261/pLT105的免疫研究中发现,重组疫苗分泌的可溶性目的抗原不能保护小鼠免受登革热病毒感染。弱毒沙门菌膜上表达的抗原决定簇与单纯的分泌型抗原相比,菌膜上表达的抗原决定簇可以诱导更强的免疫应答[5]。

2 弱毒沙门菌的研究

沙门菌致弱的根本是使之不能合成芳香族化合物的前体,在哺乳动物沙门菌致弱时,应用最多的是诱导细菌苯甲酸对位氨基的缺失。这些突变株即使对免疫缺陷型小鼠也不会致病。但是对不同类型的沙门菌来说,他们的生长速度基本相同[6]。

T3SS(type three secretion system)对沙门菌进入PP来说是必需的[7]。与沙门菌的侵袭和细胞内生存相关的功能被位于毒力岛的至少60种相关基因所调节,其中主要是对沙门菌T3SSⅠ(type three secretion systemⅠ)和T3SSⅡ(type three secretion systemⅡ)的编码调节。T3SSⅠ存在于基本上所有的沙门菌亚种,并且是非侵袭性沙门菌感染所必需的。T3SSⅡ存在于胞内寄生以及致病沙门菌。

S Typhi(Ty2 aroC-ssaV-)M01ZH09中存在一个无效突变。突变前这个基因编码T3SSⅡ中的成分,并且是参与合成细菌生长必需的一种芳香性物质[8]。这种突变型菌株作为口服疫苗已经在一个大的随机人群中进行了试验。试验表明,这种口服伤寒疫苗不会引发机体的病理表现,并且提供比目前所用伤寒疫苗更强的保护力。因此,S Typhi(Ty2 aroC-ssaV-)M01ZH 09可以作为一种理想的口服疫苗载体。

3 沙门菌载体重组疫苗的实验室研究

目前,越来越多的弱毒沙门菌作为疫苗载体成为实验室的研究对象,并且取得了较好的成果。3.1 沙门菌载体重组疫苗在细菌中的应用 Leslie W JBaillie,Marcela F Pasetti等用沙门菌突变株Typhi Ty21a组建了炭疽的重组载体疫苗。口服免疫小鼠后,少数出现对致死性炭疽孢子较强的特异性应答,免疫效果优于目前铝包被炭疽疫苗(AVA)[9];Qianli Ma,Qiao Zhang等构建的表达psaA(肺炎球菌表面粘附素A)和pspA′(肺炎球菌N-端蛋白A)的重组沙门菌疫苗可以诱导表达高水平的鼻黏膜sIgA以及血清IgG[10]。

A line F O liveira,Roque-Barreira等构建了R.equi(马红球菌)VapA抗原的重组沙门菌疫苗株。R.equi感染小鼠时发现,与非免疫小鼠相比:口服免疫小鼠呈现出了3～7倍的病原清除能力;感染后10 d,血液中病原菌数低50倍;急性感染期以及坏疽期,肝的肉芽肿降低 2倍,血清中 anti-VapA IgG2a的水平明显升高[11]。

Kulkarni R R,Parreira V R等用制备的表达产气梭菌 FBA(fructose-biphosphate-aldolase)和HP(hypothetical protein)的重组沙门菌疫苗免疫肉鸡后,可以明显的降低肉鸡坏疽性肠炎的发生,使鸡获得抵抗梭菌的能力[12];Simon MCutting,Jen-Min Huang等用构建的沙门菌载体结核疫苗免疫小鼠时,产生了强烈的MPT64抗原的细胞免疫应答,对结核菌的感染有较强的保护作用[13]。

3.2 沙门菌载体重组疫苗在病毒中的应用 Ai-Li Shiau,Chao-Liang Wu等克隆了猪的ProT cDNA(前胸腺素反转录基因),并且用低毒的S choleraesuis携带 ProT的重组质粒。结果显示,重组S.choleraesuis在小鼠中可以表达ProT,诱导机体的免疫应答[14]。

Jian-Fang Ning,Xiao-Lin Meng等使用沙门菌株SV 4089作为小龙虾白点综合征病毒(WSSV)DNA疫苗质粒的细菌载体,免疫结果显示疫苗得到了较好的呈递和释放[15]。试验说明减毒沙门菌可以作为疫苗载体应用到节肢动物中。

Aaron PWhitem,Shu-Lin Liu等以沙门菌为载体的hepatitis B virus x gene(HBX)疫苗免疫小鼠,出现了明显的CTL效应以及IFN-γ分泌型T细胞的增多。用表达有HBX的黑色素瘤细胞攻击小鼠时发现,免疫小鼠黑色素瘤的增长速度、大小以及重量与未免疫小鼠有明显的差异[16]。

4 存在的问题及展望

与其他弱毒菌株一样,弱毒沙门菌作为载体有毒力返强的问题,并且可能存在着微弱的致病性,在实际应用中受到一定的限制。作为载体使用的弱毒沙门菌菌株较少,在一定程度上限制了沙门菌载体重组疫苗的研究与发展。

分子生物学技术的发展,以及对沙门菌毒力的深入研究,将会促进弱毒沙门菌的研究进程,更多的稳定沙门菌弱毒株将会应用到载体疫苗的研制中。沙门菌载体疫苗的临床应用,将会简化免疫程序,节省大量的人力、物力。为野生动物的免疫保护提供一种新的思路。

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