树鼩驯养繁殖实验动物标准及丙型肝炎动物模型技术平台建设的探讨

孙晓梅，夏雪山，代解杰

(1.中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所，昆明 650118;2.昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 650224)

树鼩驯养繁殖实验动物标准及丙型肝炎动物模型技术平台建设的探讨

孙晓梅1，夏雪山2，代解杰1

(1.中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所，昆明 650118;2.昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 650224)

目前用于生物医学研究的树鼩大多数来源于野生捕获，由于个体间的差异较大，其实验结果的均匀性和可重复性较差，亟待解决树鼩人工饲养设施条件、繁殖关键技术、动物质量标准等一系列基础科学问题。许多文献报道了树鼩与其他实验动物比较，在肝病研究中具有巨大的开发应用潜力，在丙型肝炎动物模型研究中，亟待解决丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系、HCV病毒感染剂量与感染途径、HCV病毒对树鼩体外、体内感染后病毒核酸检测、抗体检测和病理检测等技术方法的建立及动物模型评价标准问题。本文就上述问题系统性地进行初步报道，旨在为树鼩早日实现实验动物化和丙型肝炎疾病研究中应用提供科学依据。

树鼩;饲养繁殖;实验动物标准;丙型肝炎;动物模型

树鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一种形似松鼠的小型哺乳动物。在分类学上，一直是许多学者感兴趣和争论的问题，一些学者根据其吻部较长，指(趾)端是爪，牙齿的数目和食性等特征把它列为食虫目(Insectivora)，另一些学者则根据其大脑比较发达而其上的嗅神经区较小，眼眶后有骨桥并形成骨性眼眶，中耳部构造与狐猴相似，大拇指(趾)与其他指(趾)分开及牙齿具有前臼齿等特征把它列入灵长目(Primates)中的狐猴亚目。还有一些学者则提出另立新的目-攀鼩目(Scandentia)。不管树鼩现在分类地位如何，自从1922年开始对它研究以来，有关树鼩应用于医学和生物学的研究论文就不断产生，利用树鼩开展的研究已涉及到形态解剖学、生态学、行为学、人类学、生物化学、遗传学、心理学、神经生理学、繁殖生物学、胚胎学、寄生虫学、病毒学、免疫学、病理学以及运动生理、急慢性压力的影响和应激等社会生物学的研究。

树鼩在生物医学中的应用前景越来越受到世界各地相关研究者的重视。然而目前困扰学者的最大问题是，现在供研究的树鼩还未实验动物化，相关的实验动物标准还未出台，规模化的实验室驯养繁殖还非常少。以中国医学科学院医学生物学研究所为首的，与昆明理工大学合作，目前在树鼩的驯养繁殖、实验动物标准化和树鼩丙型肝炎动物模型建立等方面做了很多研究与探索，已经取得可喜得的成绩。

1 树鼩驯养繁殖技术、种质资源库建立

中国医学科学院医学生物学研究所自1982～1993年就开始进行树鼩的驯养繁殖及动物模型建立的研究，在当时已成功建立轮状病毒动物模型。2006年开始进行规模化的野生树鼩的驯养繁殖工作，经过四年的历程，取得非常好的成效。

1.1 野生树鼩的驯化

众所周知，树鼩的“应激反应”远远超过灵长类动物，野生树鼩引种至实验室进行人工饲养首先要解决动物因应急反应造成的大规模死亡问题。作者应用实验动物饲养繁殖技术结合树鼩生物学特性，创新性地研制了树鼩驯化及繁殖的生态型不锈钢笼具(尺寸：3000 mm×4000 mm×2000 mm，每笼悬挂600 mm×200 mm×400 mm巢箱4～5个)，将野外引种的树鼩按40～50只/笼放入该笼具进行人工饲养驯化10～12周，可大大降低树鼩的“应激反应”，同时逐步适应人工饲养的环境条件和饮食习惯，死亡率可控制在5%以下。

1.2 树鼩繁殖的关键技术

将驯化好的野生树鼩转入人工饲养及实验用树鼩专用笼具(专利号：ZL2008 2 0199835.4)进行配对繁殖。经过大胆尝试和探索，室内温度控制在25～28℃，相对湿度30% ～50%，每天人工光照12 h，光照强度150～200 lx即可。饲料营养配比为：水分30%、粗蛋白 25%、粗脂肪 6%、无氮浸出物24.5%、粗纤维6%、粗灰分6%、钙1.5%、磷1%，并补给适量的水果、面包虫等营养品。已经掌握了树鼩交配规律、妊娠判定、产前准备、围产期护理等一系列关键技术，顺利建立了种群，现有400余对种群，存栏量＞1000余只(其中子代树鼩500余只)。繁殖率＞85%，成活率 ＞88.23%，每窝平均产仔数(3.62±0.74)只。成功建立了树鼩繁育的关键技术(专利申请号：200910095042.7)。在此基础上制订了《树鼩饲养管理技术规范(研究稿)》包括引种技术、驯化技术、饲养观察技术、营养饲料配制技术、繁殖技术、环境条件控制技术和疾病控制技术。

2 实验树鼩的质量标准

2.1 树鼩的质量标准控制

我们对树鼩进行了实验动物质量标准的研究，已完成微生物学指标本底的检测，肠道细菌为大肠杆菌和葡萄球菌，也伴有假单胞菌、沙门氏菌、链球菌的感染。完成树鼩体外寄生虫的检测，树鼩体外自然感染寄生虫主要是虱子、螨虫，偶见蜱虫。完成树鼩病毒抗体的检测，其自然感染主要是单纯疱疹病毒、轮状病毒、柯萨奇病毒血清抗体呈阳性。

2.2 树鼩的遗传学控制

建立了树鼩随机扩增多肽RAPD遗传标记分析方法(40条随机引物)，和微卫星分子标记(12对引物)的遗传检测方法，遗传多态检测结果表明我们饲养繁殖的树鼩群体具有较好的遗传多样性。

3 树鼩的临床指标和生物学特性

建立了树鼩血常规参数和肝功能指标的正常值数据库，在此基础上制订了《树鼩生物学特性数据检测技术规范(研究稿)》，为树鼩在医学研究中的应用提供了基础数据。下一步的目标是建成全国的树鼩种质资源库基地，为生物医药研究提供合格的实验动物化的树鼩。

4 树鼩的动物实验技术

建立了树鼩麻醉技术，麻醉剂主要有戊巴比妥钠(50 mg/kg)、盐酸氯胺酮(40 mg/kg)，一定剂量的盐酸氯胺酮和戊巴比妥钠均能对树鼩产生麻醉效果，并安全可靠;盐酸氯胺酮显效快、麻醉维持时间短，戊巴比妥钠则麻醉维持时间长，动物非常安定。

建立了实验树鼩保定技术(自制的捕捉保定袋)、采血技术(尾静脉采血可达到每次1.5 mL，股静脉采血可达到每次3 mL，心脏采血可达到每次5～6 mL)，实验树鼩灌胃给药技术。在此基础上制订了《树鼩动物实验基本操作技术规范(研究稿)》。

5 HCV感染树鼩的实验平台

5.1 稳定、高效的 HCV病毒(J6/JFH-1)细胞培养体系

从重组痘病毒(vTF7-3)感染的敏感细胞中选出Hela细胞作为国际公认的HCV病毒株(J6/JFH-1)的受染细胞，通过测定转染细胞中 HCV RNA合成、结构蛋白和非结构蛋白的表达情况以及HCVcc结构形态，建立及优化病毒株(J6/JFH-1)的细胞转染体系。通过RT-PCR、Western blot及感染Huh7等方式建立每批次HCVcc的核酸、蛋白及感染效率质量控制标准，为树鼩HCV感染模型的研究工作提供稳定质量控制的 HCVcc(病毒载量达到108copies/mL)，所得到的 HCV细胞培养病毒上清液，具有HCV病毒复制性和感染性。

5.2 树鼩原代肝细胞分离培养及HCV对其感染性研究

采用活体腹腔肝脏暴露，二步灌流、胶原酶消化法获得树鼩原代肝细胞，每次分离的原代肝细胞产量达5×108以上，细胞纯度达95%以上，细胞成活率为90%，通过多种培养基培养实验，建立了树鼩原代肝细胞培养。结合树鼩原代肝细胞(PTH)生长曲线特征，选择其指数生长初期(2～4 d)，以高毒力J6/JFH-1嵌合型 HCVcc(病毒载量 1×108IU/mL;病毒滴度1×106ffu/mL)对子代小树鼩原代肝细胞进行感染获得HCVcc感染PTH病毒增殖动力曲线，结果显示，病毒在PTH中随时间的变化有明显的增殖变化，其中第1天和9天 HCV RNA增殖最高水平可达5.5 Log10 IU/mL、5.2 Log 10 IU/mL，细胞上清RT-PCR检测成阳性，测序结果比对分析正确，并证实该PTH产生上清对人肝癌(Huh7.5.1)细胞具有较好感染性。在此基础上制订了《HCV病毒感染树鼩原代肝细胞模型制作技术规范(研究稿)》。

5.3 树鼩IgG抗体的制备

采用辛酸-硫酸铵沉淀并结合Sephacryl-S200凝胶过滤层析和DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析分离纯化树鼩血清免疫球蛋白G(IgG)，树鼩血清中IgG的分子量约为160×103，其重链分子量为53.5×103，轻链分子量为28.4×103。成功的制备了特异性好、质量高的兔抗树鼩IgG的多克隆抗体其效价达1∶25 600;同时得到了大量的高浓度鼠抗树鼩的IgG单克隆产量约为1～5 mg/mL。在已得到的树鼩IgG多抗和单抗的基础上，建立了ELISA和Western blotting的检测方法。申请发明专利：抗树鼩 IgG单克隆抗体的制备方法(申请号：200910094864.3)

5.4 树鼩中HCV受体和抗体的研究

为了从树鼩中HCV的受体的角度进一步证实其作为HCV的感染动物模型的可能性和初步对HCV的慢性感染机制。以树鼩肝组织中提取的核酸为模板，扩增了CD81(711 bp)、SR-BI(1041 bp)、Claudin-1(636 bp)三个受体基因片段，并以各受体基因片段PCR产物通过TA克隆完成测序，在此基础上进行了它们和不同物种间的保守性和序列差异性分析。结果发现：与人相比较，核苷酸序列同源性CD81、SR-BI、Claudin-1分别为 91.4%、87.5% 和90.9%;氨基酸序列同源性三个分子分别为96.2%、88.0%和93.4%。经 HCV感染受体关键位点分析发现，CD81分子与人有9个差异性位点，6个在胞外大环区(LEL区)，HCV感染所需的关键位点与人基本一致;Claudin-1共有14氨基酸位点与人类有差异，胞外大环区有3个。SR-BI受体氨基酸序列与人有较大差异，61个差异位点中LEL区有44个。相比而言，所研究的树鼩的CD81和 SR-BI受体更接近于灵长类动物而远于鼠类。

5.5 树鼩CD81荧光实时定量PCR技术

根据CD81核苷酸序列，设计并合成了引物和Taqman探针，并对其反应条件进行了优化，结果发现：在25 μL反应体系中，反应主要条件为退火温度60℃、引物浓度 200 nmol/L、探针浓度100 nmol/L。经已知拷贝数标本(103、104、105、106、107拷贝)进行检测，绘制了标准曲线，CT值与拷贝数的对数值之间有很好的相关性(R2=0.9996)。通过批间、批内、组间、组内四个水平对该方法进行了重复性、稳定性评价，确定该方法具有较高的稳定性和可重复性，各项变异系数均小于5%。经检测灵敏性评价，该方法可以检测到每个反应相当于1×102copies CD81核酸分子。对 HCV感染不同时间(8、12、16、20 h和24 h)的树鼩原代肝细胞(PTH)，进行了HCV-RNA检测，并用该方法检测了其CD81分子表达量，结果发现：在HCV感染不同时间的PTH中可以检测到HCV-RNA，随着HCV的感染和增殖，树鼩中CD81的表达量下降，下降曲线无规律性。该方法已申请发明专利：以树鼩CD81基因构建的质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法(申请号：200810233735.3)。

5.6 HCV病毒体内感染模型

用国际公认的(J6/JFH1)标准毒株培养的HCV病毒培养液(HCVcc)静脉或肝脏注射等方式，在具有生物安全保护的专用实验笼具——独立换气树鼩专用隔离笼具(专利申请号：201020242799.2)体内感染F1代仔树鼩，约20% ～25%的树鼩在2～18周相继出现病毒血征或呈慢性持续性感染症状，病毒载量在102～105copies/mL之间，肝功能中 ALT指标最高可达到265 U/L，进一步证实树鼩可作为HCV病毒感染研究的实验动物。对感染树鼩进行肝脏活体病理学检测发现，肝细胞损伤或部分组织纤维化，进一步证实树鼩可作为HCV病毒感染研究的实验动物。在此基础上制订了《HCV病毒感染树鼩模型制作技术规范(研究稿)》。

6 问题与展望

树鼩能否替代黑猩猩成为HCV疾病动物模型研究、抗HCV药物和疫苗筛选与评价的理想实验动物?必须解决树鼩的实验动物化标准的一系列基础科学问题，尤其是遗传学特性研究，对于提高目前树鼩对HCV病毒感染率不高将有重要意义。同时，HCV感染树鼩后，树鼩的细胞免疫和体液免疫的检测技术方法的建立，是评价病毒感染树鼩免疫机制的重要的技术手段。相信在不远的将来，树鼩将会成为实验动物家族中的一个新成员，为人类健康做出应有的贡献。

Exploration of laboratory animal standard of domesticated and bred Tupaia belangeri and construction of a technology platform of a Tupaia belangeri model of hepatitis C virus(HCV)infection

SUN Xiao-mei1，XIA Xue-shan2，DAI Jie-jie1
(1.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Kunming 650118，China;2.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224)

At present，the Tupaia belangeri used for biomedical studies is mainly sourced from wild field capture.Due to the variation of interindividual differences，there are still some shortages in the homogeneity and the repeatability of experiments on those animals.There are problems demanding prompt solution on a series of basic scientific questions such as the management，critical techniques for breeding and the animal quality control standard in Tupaia belangeri.A lot of researches have reported that the Tupaia belangeri has a huge exploitation potential on the liver disease research compared with other laboratory animals.In the studies of animal models of hepatitis，there are problems need to be solved promptly on the cell culture system of HCV(hepatitis C virus)，the infection dosage and route of HCV infection，the RNA，the antibody and the pathological examination after HCV infection in vivo and in vitro，and also how to evaluate the animal model.This paper will briefly discuss the above mentioned questions，in order to provide a scientific basis for implementing experimental animalization and the use of the Tupaia belangeri in HCV disease studies.

Tupaia belangeri，Domestication;Breeding;Standard of experimental animals，Hepatitis C，Animal model

Q95-33

A

1005-4847(2011)02-0172-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.017

国家科技支撑计划重点项目(批准号：2009BAI83B02)，云南省科技基础条件平台建设计划项目(编号：2006PT07-2)。

孙晓梅(1963-)，女，研究方向：实验动物学及疾病动物模型。Email：sxm@imbcams.com.cn

代解杰，研究员，项目负责人。Email：lzldjj@gmail.com夏雪山，教授。Email：oliverxia2000@yahoo.com.cn

2010-12-27