沙门氏菌分子生物学研究进展＊

黄静玮,汪铭书,程安春

沙门氏菌分子生物学研究进展＊

黄静玮1,2,3,汪铭书1,2,3,程安春1,2,3

自1885年Salmon等分离得到猪霍乱沙门氏菌以来,目前已检出沙门氏菌血清型2500余种,我国已有292个血清型报道[1]。沙门氏菌是重要的人兽共患病病原菌之一,本文就沙门氏菌基因组学、鞭毛蛋白、外膜蛋白以及毒力岛等方面研究进展进行总结,以期为开展相关研究提供参考。

1 基因组特征

研究发现沙门氏菌具有属特异性基因、血清群特异性基因及血清型特异性基因。属特异性基因包括 inv、hut、hns、spv、fim、hilA 、16SrDNA 等[2],血清群特异性基因主要为 rfb,血清型特异性基因包括 f liC、f ljB、via等,filC可作为甲型副伤寒沙门氏菌特异性检测基因[3]。

分析副伤寒沙门氏菌基因组发现,其与鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等沙门氏菌间约有90%的共同基因,而生物学性状差异主要由10%左右的基因决定,这10%的基因结构常具有可塑性,可以不同方式重组表现不同功能[4]。与其他沙门氏菌相比,副伤寒沙门氏菌与伤寒沙门氏菌基因具有更高的同源性。丙型副伤寒沙门氏菌RK4594高分辨图谱,与伤寒沙门氏菌L T2图谱相似[5]。甲型副伤寒沙门氏菌SPA-2-Sop E与伤寒沙门氏菌Sop E高度相似[6],其差异主要在于前噬菌体和假基因。通过假基因的形成、密码子替换、突变、基因缺失可导致甲型副伤寒沙门氏菌小序列的多样性和基因功能改变,从而使其在感染宿主过程中可寻找更适合的靶位置。有报道指出在甲型副伤寒沙门氏菌存在43个特异性蛋白质编码序列以及多种小片段的隐藏质粒 ,stk F、spa2473、spa2539、hsdM 是其特异性的靶位点[7]。

Hfq与沙门氏菌毒力密切相关,超过30%的非编码sRNA可与 Hfq蛋白结合,从而影响 RNA的稳定性或通过辅助非编码sRNA与m RNA结合以调节靶基因表达[8]。Hfq与 RNase结合形成的降解复合体,可同时降解 sRNA和m RNA,以抑制目的基因表达。此外 Hfq还能够影响多种细菌外毒素表达[9]。

2 外膜蛋白

外膜蛋白可分为主要蛋白:微孔蛋白、脂蛋白、OmpA、OmpB、OmpC、Omp F和微量蛋白。

2.1 编码外膜蛋白核苷酸的同源性 通过外膜蛋白抗原相似性的高低,可判断细菌亲缘关系的远近。沙门氏菌外膜蛋白基因表达和抗原性具有较高的相似性,不同地区沙门氏菌DNA往往可以编码同一种外膜蛋白,但沙门氏菌外膜蛋白编码基因也可通过后天获得[10]。外膜蛋白的表达常由sRNA调节,目前已发现8个OM P调节 sRNA:InvR、M icA、M icC、M icF、Om rAB、RseXand、RybB,但具体调节机制尚未明确[11]。与OmpC和Omp F高水平表达相比ompS1、omp S2编码的孔蛋白仅处于低水平表达状态。OmpB、OmpC、Omp F、OmpS1、Omp S2 在表达过程中相互作用,并且受LeuO、H-NS、M icC、M icF、hfq、OmpR/EnvZ、Rcs系统等调控[12-13]。在高渗应激条件下hfq与OmpR/EnvZ、Rcs系统存在交叉调节,但具体机制尚未明确。

Omp S1有 3个操纵子:Pl、P2、P3。Pl控制OmpR的起始表达,只有在 Pl存在时OmpR才会表达;当OmpR缺失,P2参与Omp S的低水平表达;P3有微弱的连续的活性,对Omp R表达起辅助作用[14]。OmpS1的基因表达既不受渗透压诱导,也不受负调控机制中的IHF调节子的影响,与大肠埃希菌 K-12有一定的同源性,均具有开放式阅读框架。

2.2 外膜蛋白的免疫学特性 副伤寒沙门氏菌外膜蛋白 PagC、Omp X、NmpC、FadL、TolC 和 BtuB等均具有较强的免疫原性,可诱导机体产生强烈而持久的免疫应答,尤其以OmpC介导的体液免疫应答为甚,当外膜蛋白以非共价键与肽聚糖紧密结合,形成相对非特异性的通道时具有高度的保守性[12]。

3 鞭毛蛋白

沙门氏菌鞭毛蛋白可引起强烈的免疫应答,是沙门氏菌重要的致病因素,可在不同环境中表达出不同类型。鞭毛蛋白是沙门氏菌鞭毛丝状部的结构蛋白(即 H抗原),由fliC或fljB编码[15]。

3.1 分型 H抗原 H抗原可分Ⅰ和Ⅱ相,Ⅰ相特异性高且抗原性存在较大差异,Ⅱ相特异性低且为多种沙门氏菌所共有。H1抗原在沙门氏菌中普遍存在,经测序发现不同血清型沙门氏菌重 H 1鞭毛蛋白决定细菌的结构和功能的两端的氨基酸序列高度保守,而决定细菌的血清型得中间区高度变异,IV、V I区的同源性分别低于27%、39%。

甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白仅有 I相 H抗原a(H la),H1a与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FIiC的核苷酸及氨基酸序列高度相似[16]。甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC与伤寒杆菌等沙门氏菌鞭毛蛋白具有相同的抗原决定簇,存在明显的抗原和抗体交叉,可结合 TOLL样受体-5,常与 CD4+/CD8+T细胞相互作用[17]。甲型副伤寒沙门氏菌 H la、FliC、SpaO蛋白单克隆抗体对实验感染动物均有明显保护作用,在自然感染病人血清中也能检出相应抗体。但通过鞭毛基因 FliC测序以及对 I相鞭毛抗原进行基因血清分型和鉴定发现在分子水平上并不能把 H∶d和 H∶z42以及 H∶g、q和 H∶g、m、q区分开[18]。

3.2属特异性共同抗原 沙门氏菌鞭毛蛋白上存在属特异性抗原决定簇,其共同抗原表位是沙门氏菌属的识别标志,具有高度属特异性和属内保守性。属特异性共同抗原同时存在于 I相及Ⅱ相鞭毛;在属内同源性较高且广泛存在,而属间出现的频率很低且不受鞭毛位相改变的影响。但不同于O抗原和H分型抗原的分布特征,沙门氏菌鞭毛上可存在多个属特异性抗原表位。属特异共同抗原免疫原性较好,但其免疫性比分型 H抗原弱,提示沙门氏菌分型H抗原表位是鞭毛蛋白分子上的优势表位。

4 毒力岛及Ⅲ型分泌系统

4.1 毒力岛 沙门菌毒力岛(SPI)指与沙门氏菌侵袭力相关的毒力基因及操纵子聚集成簇分布于细菌染色体的某些特定区域,而这些毒力基因在染色体组成相似的大肠埃希菌中并不存在。目前研究最广泛的是 SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4 和 SPI-5,而在伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌中新鉴定出的 SPI-6、SPI-7、SPI-9、SPI-11、SPI-12、SPI-17被陆续报道[6]。各岛的各种毒力基因均受dam、pho P/phoQ等调节基因调节,若删除调节基因,细菌毒力将大大降低[19]。

SPI-1 含 inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iae、prg、sic基因[20-21],编码包括调节子和分泌性效应蛋白在内 T3SS的各种成分,其效应蛋白与细菌和宿主细胞的粘附有关,可引起肠黏膜细胞上的肌动蛋白发生重排,有利于沙门氏菌的内化。其表达受HilA、HilD、InvF、inv/spa、p rg操纵子和 pp Gpp 调控[22-23],Hfq可在 SPI-1基因表达中扩增[8],并受PL lacO-1启动子调节[24],是 InvR积聚的关键,但其对sRNA编码区域的毒性尚未明确。InvR由转录子 HilD,HilC激活,同时 HilD,HilC可拮抗 HilA作用[25]。

SPI-1编码的蛋白质可入侵宿主非吞噬细胞,离体诱导巨噬细胞凋亡,在沙门氏菌侵袭巨噬细胞和肠上皮细胞过程中发挥重要作用。

SPI-2的含4个操纵子:ssa编码 T3SS成分,ssr编码分泌系统调节子,ssc编码分子伴侣,sse编码分泌系统效应蛋白[26]。H-NS是SPI-2分泌的主要蛋白,与A T含量丰富的区域结合,表达主要受IHF、Fis、PhoP、SpiR/SsrB、ydg T/SsrB、hha/SsrB调控[27-29]。SPI-2可控制沙门氏菌在吞噬细胞和上皮细胞内的复制,并使沙门氏菌逃避巨噬细胞辅酶Ⅱ依赖的杀伤作用。

SPI-3含10个开放阅读框,组成6个转录单位,其中mgtCB的产物编码的M g2+转运子可介导细菌在巨噬细胞和低M g2+环境中存活[30]。

SPI-4含18个开放阅读框,但大多表现为SiiA至F6个开放阅读框,其中SiiE是最主要分泌的蛋白,主要由 I型分泌系统分泌,其调控与 SPI-1相关,编码介导毒素分泌的I型分泌系统,并参与调节细菌适应巨噬细胞内环境,但具体功能有待研究[31]。

SPI-5含 sop、sig、pip,编码参与肠粘膜液体分泌和炎症反应的相关蛋白,并且由 SPI-1和SPI-2编码的蛋白所调控[32]。

另外在丙型副伤寒沙门氏菌中新鉴定出的SPI-7长 134kb,含 Sop E噬菌体、viaB操纵子、phoN基因、一个临近 tRNA pheU位点的75kb的片段和一个编码 IV型鞭毛的区域的钩端螺旋体。当DNA片段插入基因序列,可改变基因平衡状态,以优化基因结构,对DNA转化、活化以及稳定性保护存在一定功能[33]。

4.2 Ⅲ型分泌系统(T3SS) Ⅲ型分泌系统(T3SS)是SPI-1和SPI-2编码特异性的蛋白分泌和转运系统,包括至少20种内膜蛋白及外膜蛋白。沙门氏致病的毒力因子由20～50个基因组成的基因簇编码的 T3SS分泌的蛋白和其靶蛋白组成,这些毒力因子直接或间接刺激细胞转导信号,引起一系列细胞反应[34]。

T3SS蛋白分子量大多在26～85kDa之间,普遍含外膜蛋白 InvG、PrgH和 Prg K,内膜蛋白 InvA、SpaP、SpaQ、SpaR 和 SpaS,附属蛋白 SicA、Inv I、IacP、InvH和OrgA。可按功能将其分为两类:一类发挥蛋白分泌功能,另一类将蛋白转送到宿主细胞的效应分子,这两个系统具有很高的同源性,其中InvJ和SpaO是 T3SS必需的特异性蛋白,SipB和SipC是沙门氏菌进入宿主细胞的功能蛋白[35]。电子显微镜分析表明,SPI-1编码的 T3SS是一种在生化和结构上均类似于细菌鞭毛系统的“针状复合物”,该复合物编码的 Prg K、PrgH、InvG,、InvA、Prg I、Prg K等,PrgH或InvG的突变可导致细菌入侵非吞噬的上皮细胞所必需的效应蛋白 SipA、SipB、SipC、SipD等分泌受阻[35]。SPI-1分泌的 Sip A、SipC、Sop E、Sop E2和 SopB通过调节宿主肌动蛋白细胞骨架,促使细菌入侵宿主细胞[21]。SPI-2效应蛋白通过调节细菌在细胞内的移动,关系到细菌在宿主细胞内的存活。

T3SS的调控主要受时间和空间的限制,转录后调控机制在与宿主细胞相互接触后发挥其功能,入侵基因表达的调控由转录水平的环境因素决定的。目前,在分子水平仅发现DNA的超螺旋结构会影响蛋白的分泌。在蛋白水平 InvF和 HilA参与沙门氏菌的入侵。InvF属于转录激活子A raC家族;HilA属于转录激活子Omp R/ToxR家族,HilA又调节orgA、sipC和invF,它们形成一个调控茎环结构[36]。此外,T3SS还受到调控网的影响,如菌毛调控系统、PhoP/PhoQ[27]调控系统和反应调节蛋白等。

5 展 望

沙门氏菌是目前研究较为广泛的人兽共患病致病菌之一,但对沙门氏菌的研究主要集中于沙门氏菌属的相关研究,而对于沙门氏菌单独的种以及亚种等的特异性研究相对较少。虽然已知沙门氏菌不同种的基因组之间具有较高相似性,但具有种特异性的基因尙不十分明确,因此筛选种特异性基因有利于建立特异性检测方法,实现对沙门氏菌菌种的快速诊断、流行病学调查以及监测控制。另外,阐明尙不清楚的沙门氏菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、SPI、T3SS的基因及蛋白相互调节的机制,对于阐明其分子致病机制、研发新药及疫苗有着重要指导意义,应该成为今后的重点研究方向之一。

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1002-2694(2011)07-0649-04

R378.2

A

＊教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队项目(IRT0848)

程安春,Email:chenganchun@vip.163.com

1.四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心,雅安625014;2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安 625014;3.四川农业大学预防兽医研究所

2010-11-06;

2011-04-25