TMEM16A:钙激活氯通道研究进展

刘雅妮，张海林

(河北医科大学药理学教研室，河北石家庄 050017)

钙激活的氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)广泛分布在内皮细胞、上皮细胞、甚至血细胞等非兴奋细胞，及心肌细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞等可兴奋细胞。第一次发现CaCCs是在爪蟾的卵母细胞中［1］。胞质内钙离子浓度(［Ca2+］i)的升高引起CaCCs的开放，使膜发生去极化，而抑制多精受精。CaCCs在许多生理活动中起重要作用，如上皮细胞的分泌、心肌和神经元的兴奋、嗅觉转导等。

由于技术上的原因，CaCCs分子基础的问题一直未能解决，曾有报道认为CLCA、ClC-3、Bestrophins是CaCCs分子基础的候选基因，但以上蛋白分子产生的氯离子电流都与典型的天然CaCCs通道有明显区别。最近几个研究小组几乎同时报道了CaCCs的分子基础是跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)［2－4］，这将为在特定细胞和组织中研究氯离子通道的生理病理相关问题及其作用机制提供新的研究平台。

近年来研究发现TMEM16A在非兴奋性组织起源的肿瘤中高表达［5］，而在相同起源的正常组织低表达或不表达。但是TMEM16A在肿瘤的发生发展过程中的作用尚不清楚。

1 CaCCs分子基础及构效关系

1.1 分子基础 对于CaCCs的分子基础，曾有过几个候选者。第一个是CLCA，它是从牛的气管中分离得到的蛋白。编码各种CLCA蛋白的cDNA转染多种细胞系均能诱发钙依赖的电流。然而，Gibson等人的研究表明CLCA蛋白是细胞粘附分子，可粘附在细胞表面或被分泌到细胞间质中。ClC-3是CaCCs的另一个候选者。但是ClC-3产生的电流缺少电压依赖性和钙依赖性，而CaCCs是可被钙离子直接激活的。ClC-3还与细胞容积激活的氯通道活性有关，但是ClC-3敲除小鼠有正常的钙离子和容积激活的氯电导。Bestrophins最初是作为卵黄斑营养不良的相关蛋白发现的，是CaCCs的另一个候选者［6］。与经典的天然CaCCs相比，bestrophins表达的氯电流对钙离子有不同的亲和力，电压依赖性和对抑制剂的敏感性也不同。最近的研究表明，bestrophins为钙离子通过内质网膜提供电动力［7］。

2008年，3个研究小组几乎同时用不同方法独立指出了TMEM16A是CaCCs的分子基础。体内或体外TMEM16A沉默都能引起内源性CaCCs功能的抑制。另一方面，在裸细胞表达异源的TMEM16A表现有钙激活氯通道生理和药理学特征。如，TMEM16A的离子选择性顺序(NO－3＞I－＞Br－＞Cl－＞F－)与报道的内源性 CaCCs相似［8］。另外，TMEM16A表达产生的氯离子电流可被尼氟灭酸(niflumic acid，NFA)、5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(5-nitro-(3-phenylp ropylamino)-benzoic acid，NPPB)［9］、4，4'-二异硫氰酰-2，2'-二磺酸(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'-disulfonicacid，DIDS)抑制，他们的效价与报道的 CaCCs相似［6］。而后续研究表明TMEM16A与氯通道活性相关［10］。报道的高度一致表明了TMEM16A独立构成了CaCCs或者与其他未知蛋白共同构成了CaCCs。

1.2 构效关系 TMEM16A有8个跨膜结构域，氨基和羧基末端都在膜内。由于8个跨膜区域的拓扑结构和其在阴离子转运中的作用，TMEM16A也叫做 ANO1(anoctamin-1)。第5、6跨膜区带正电荷的氨基酸突变成带负电的谷氨酸可明显改变通道对阴阳离子的通透性，即改变通道的离子选择性，这一实验初步推断第5、6跨膜区可能形成一个折返环插入质膜中，对通道孔的形成可能有贡献［4，11］。但是，TMEM16A序列中并没有熟知的钙离子或钙调蛋白结合位点，如EF手结构。如果TMEM16A可以直接结合钙离子，那很可能是通过一个新的未知微域。膜内第一个折返环的4个紧邻谷氨酸有可能是钙离子结合位点。这一结构与钙激活钾通道的“钙碗”相似［12］。

TMEM16A 有 4 个可选择剪切片段 a、b、c、d，分别对应116、22、4、26 的氨基酸长度［13］。对人的不同组织器官分析TMEM16A片段结果显示有多种表达模式。许多组织表达不同亚型:表达会跳过b或d，这一协调的模式可能说明片段b和d功能互斥［7］。相反，c片段是都有的，但在大脑和骨骼肌上也有很小的跳跃。TMEM16A的氨基末端有一长片段a，当有可替代启动子时也可跳过，这就导致蛋白缺少开始的116个氨基酸。但是缺少片段a转录出的蛋白也没有片段b，c，d。这种亚型叫做TMEM16A(0)，只有840个氨基酸，而完整的TMEM16A(abcd)有1 008个氨基酸［2］。

膜片钳实验显示TMEM16A的不同选择剪切有不同的功能。片段b能减少TMEM16A通道对钙离子的亲和力。因此，TMEM16A(abc)和TMEM16A(ac)对钙离子的敏感性相差近4倍［13］。另外，4个氨基酸(谷氨酸－丙氨酸－缬氨酸－赖氨酸)对应于片段c能改变电压依赖性。有趣的是，片段c位于上述讨论的可能的钙结合位点4个谷氨酸残基后面。表达异源的TMEM16A(0)会产生不同的氯电流，虽然是钙依赖性的但是不受膜电位影响。此亚型的生理学特征还不清楚。

1.3 其他TMEM16蛋白 TMEM16A属于TMEM16家族，此家族还包括其他9个成员，分别从 B到 K［5］。所有的TMEM16蛋白的拓扑结构相似，但同源性较低。TMEM16A的氨基酸序列有60%与16B相似。TMEM16B似乎也是构成CaCC的分子基础。与TMEM16A相比，TMEM16B的电导低10倍，钙离子敏感性更低，动力学活性更快［14］。这些不同可能指导识别通道门控和氯离子转运的关键蛋白域。TMEM16A与其他家族成员的同源性较低，与F、G、H、K相似度只有20% ～30%。然而，TMEM16的跨膜结构部分的一级结构，显示了高度的序列保守性。这些差异较多的TMEM16蛋白可能编码不同的其他离子通道或转运体。TMEM16F和16K在很多细胞和组织中高表达［15］。相反，TMEM16C和16G只特异性的分别表达在神经系统和前列腺。有趣的是，TMEM16E/ANO5(也叫做GDD1)是目前为止发现的唯一一个与人类遗传疾病相关的TMEM16基因。TMEM16E蛋白的生理学功能还不清楚，但是已知它位于细胞内。有报道指出包括TMEM16A在内的许多TMEM16蛋白，产生的氯电流是由细胞肿胀引起的［16］。然而，与TMEM16有关的氯离子通道的生理物理学特性与容积敏感的氯离子通道(volume sensitive chloride channel，VSOAC)不同。因此，TMEM16和VSOAC可能代表着与细胞体积调节有关的不同类型的通道。

2 CaCCs的生理功能

2.1 上皮细胞分泌 CaCCs表达和发挥功能的重要位置之一就是上皮细胞。CaCCs为氯离子通过上皮细胞提供了路径。分泌液通过转运体进入呼吸道，细胞内积累的氯离子产生电化学梯度，通道开放，氯离子流入细胞外间隙而降低电化学梯度。Tarran等［17］用ATP或 UTP刺激气管，发现其会激活上皮细胞上的P2Y2嘌呤能受体，从而诱发Ca2+依赖的Cl－的分泌。UTP激活Gq-P2Y嘌呤能受体可释放IP3进而引起Ca2+的释放。呼吸道上皮细胞共表达CaCCs和囊性纤维化跨膜通道调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)，上皮粘膜层似乎由 CFTR和CaCCs共同调节［17］，粘膜层的基础水平由 CFTR控制，CaCCs则为液层的敏感调节因子。卡巴胆碱、组胺和核苷酸能引起肠道内氯离子的短暂上调。这些激动剂增加了胞内钙离子浓度，激活CaCCs进而触发了分泌活动。然而，从囊性纤维性病人体内得到的肠上皮细胞对这些激动剂却不敏感。所以虽然肠上皮细胞存在着CaCCs，但是他们的重要作用还需进一步研究确定。

2.2 神经兴奋和心脏兴奋性的调节 各种不同的神经元细胞都有CaCCs的表达，如背跟神经节(dorsal root ganglia，DRG)神经元、脊髓神经元等。CaCCs在神经元细胞中的功能还不是十分确定，但它们在动作电位的复极化，膜振荡行为中起关键作用。45%～90%的躯体感觉神经元，如感受皮肤温度、触觉、肌张力、疼痛的神经元，都有 CaCCs的表达［18］。躯体感觉神经元的胞体构成了背根神经节，DRG可传导不同刺激如皮肤温度、疼痛和触感。DRG的一个亚群——中等直径(30～40 μm)感觉神经元中显示了 CaCCs的活性，这表明此通道与某些特殊的感觉传导通路有关。最近的研究［10］表明小DRG神经元上的CaCC电流介导了缓激肽(bradykinin，BK)引发的急性伤害性疼痛。BK通过B2受体和磷脂酶C级联反应使内钙释放进而激活CaCC。脊髓神经元中也有CaCCs的表达。在脊髓神经元中，Ecl约为±60 mV［6］。如果在动作电位期间CaCCs开放，可能会加速膜的复极化。这往往会限制动作电位的重复发生。

CaCCs在许多物种的心肌动作电位去极化过程中起了重要作用。在许多心肌细胞中，短暂的外向电流Ito2和Ito1对复极化的初相作用重大。Ito1是Ca2+敏感的K+电流，可被4-氨基吡啶抑制，Ito2是Ca2+激活的Cl－电流，却对4-氨基吡啶不敏感［6］。CaCCs激活可产生Ito2，可导致膜去极化或复极化。在膜电位较正时，钙-氯电流(ICl.Ca)为外向电流，氯离子内流，使膜电位变负。在膜电位较负时，氯离子外流，ICl.Ca能加速去极化和早后除极。Ca2+的状态起了关键作用，决定了CaCCs对总的瞬时外向电流的相对贡献。例如，β-肾上腺素刺激L-型通道或使心率加快可增加CaCCs的活性，也加大了钙-氯电流对膜复极化的贡献［6］。相反，膜电位的早复极化限制了钙的内流，从而也限制了CaCCs的激活。

2.3 嗅觉转导 蛙、大鼠、蝾螈的嗅觉感受器神经元都有CaCCs的表达［6］。CaCCs对嗅觉刺激的传导起重要作用。气味会结合并激活嗅觉感受器神经元纤毛膜上的G蛋白偶联受体。这些受体激活腺苷酸环化酶，产生cAMP并打开环核苷酸门控的通道，使Na+和Ca2+内流。这样就导致膜的去极化，使纤毛的［Ca2+］i升高，从而激活CaCCs。氯离子的外流(内向电流)使膜进一步去极化。药物对气味转导机制中产生的ICl.Ca有重要作用。在蛙的嗅纤毛，大鼠、非洲爪蟾、蝾螈的嗅觉感受器神经元，尼氟灭酸(NFA)，氟芬那酸都可以抑制 ICl.Ca。

3 与肿瘤的关系

3.1 TMEM16A与肿瘤的关系 TMEM16A多年前就引起了肿瘤生物学家的兴趣，那时还不知道它是离子通道，只知道他们在肿瘤细胞中高表达［5］。因为他们接近细胞表面而且在肿瘤细胞中高表达，因此他们被当做治疗的潜在靶点和肿瘤的生物标记物。离子通道在肿瘤细胞中发挥着重要作用，这并不是一个新的观点，但是此通道家族对肿瘤蛋白质组的研究却提供了一个新的机制研究前景。胃肠间质细胞瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是在胃肠道中发现的最普遍的间质细胞瘤。TMEM16A在此肿瘤中高表达［19］，现已成为鉴定GIST的标志基因。虽然TMEM16A不是肿瘤发生的起因，但它可能支持肿瘤的发展。TMEM16A位于染色体11q13，而在很多肿瘤组织中该染色体区都是扩增的，这包括几乎一半以上的鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCC)，人颈鳞状细胞癌。这就表明染色体11q13的扩增是由一组能促进肿瘤细胞增殖和迁移的基因驱动的。

虽然TMEM16A在肿瘤组织中高表达，但TMEM16A的突变与致癌作用并没有联系。更确切说，TMEM16A可能参与了细胞增殖或肿瘤发展。Kramer等发现当果蝇中TMEM16(Axs)点突变后会导致染色体不分离而影响减数分裂周期。Axs与TMEM16H、K有35%的相似。与他们一样，Axs缺少折返环。这是否意味着Axs不是一个氯通道或者说这部分蛋白对氯通道的功能是可有可无的，仍需验证。Axs在胚胎发育早期位于内质网，在减数分裂纺锤体期位于膜上。Axs点突变后Axs(D)会导致染色体不分裂，这表明在纺锤体形成和细胞周期进程中存在损伤。然而有趣的是，敲除Axs并不能重现Axs(D)的现象［20］。可能是因为点突变Axs(D)会产生具有打乱减数分裂功能的新蛋白。而敲除后其他的TMEM16家族成员会替代Axs的功能。

3.2 其他TMEM16蛋白 其他的TMEM16蛋白与肿瘤也有关系。TMEM16G，也被叫做NGEP，特异性的表达在前列腺癌中［21］。TMEM16G剪切片段影响小鼠乳腺癌的迁移能力，而且与人类乳腺癌预后不良有关。因为TMEM16G在前列腺的特异表达，或许会成为潜在治疗靶点。

4 TMEM16A功能特异性调节剂

在鉴定TMEM16A为CaCCs的分子基础后，很多实验小组着眼于研究TMEM16A的抑制剂，并取得了很大进展。Namkung等［22］发现红酒和绿茶中存在的天然化合物鞣酸能明显抑制TMEM16A电流而不影响CFTR和ENaC(Na+转运体)，同时也不影响ATP和ionomycin诱发的胞内钙离子浓度升高，其 IC50为6 μmol·L－1。鞣酸浓度较高时能完全抑制TMEM16A电流，但同时也能抑制TMEM16B介导的电流。而Namkung等［23］的药物筛选研究发现小分子抑制剂苯并吡唑类化合物能明显抑制TMEM16A电流，抑制作用较强的A组化合物结构母核为硫代乙酰基连接的嘧啶环与苯并吡唑环，其中抑制作用最强的化合物T16Ainh-A01的IC50仅为1 μmol·L－1。这些抑制剂直接作用于TMEM16A，而不是作用于上游(如与激动剂结合或钙离子信号)。虽然小分子抑制剂能明显抑制TMEM16A电流，但也会同时抑制TMEM16B电流，所以筛选TMEM16A功能特异性的调节剂仍须努力。分子抑制剂的发现对于研发治疗高血压、疼痛、腹泻等疾病的药物提供了支持。

5 结语

TMEM16A基因被报道为CaCCs的可能分子基础后，其成为了众多研究者的焦点，并取得了一些进展。如Manoury等［24］发现在人肺动脉平滑肌细胞上，TMEM16A介导了CaCCs电流。另有研究表明颌下腺腺泡细胞和肝胆管上皮细胞均有TMEM16A的表达。尽管由于发现TMEM16A为CaCCs的分子基础后对CaCCs的研究有了很大进展，但仍存在有许多悬而未决的问题。如在CaCCs的钙离子结合位点、CaCCs特异性抑制剂、TMEM16A基因在肿瘤发生发展过程中的作用及其影响机制，以及TMEM16家族其他蛋白功能等方面仍存在很多待解决问题。而TMEM16A或许会成为治疗多种人类疾病如囊性纤维性病、高血压、胃肠蠕动障碍、哮喘和肿瘤的新型药物靶点。

［1］ Miledi R.A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes［J］.Proc R Soc Lond B Biol Sci，1982，215(1201):491－7.

［2］ Caputo A，E Caci L，Ferrera，et al.TMEM16A，a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity［J］.Science，2008，322(5901):590 －4.

［3］ Schroeder B C，Cheng T，Jan Y N，et al，Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit［J］.Cell，2008，134(6):1019 －29.

［4］ Yang Y D，Cho H，Koo J Y，et al.，TMEM16A confers receptoractivated calcium-dependent chloride conductance［J］.Nature，2008，455(7217):1210－5.

［5］ Galindo B E，Vacquier V D.Phylogeny of the TMEM16 protein family:some members are overexpressed in cancer［J］.Int J Mol Med，2005，16(5):919－24.

［6］ Hartzell C，Putzier I，Arreola J.Calcium-activated chloride channels［J］.Annu Rev Physiol，2005，67:719 －58.

［7］ Ferrera L A，Caputo，Galietta L J.TMEM16A protein:a new identity for Ca2+-dependent Cl－channels［J］.Physiology(Bethesda)，2010，25(6):357－63.

［8］ Duran C，Thompson C H，Xiao Q，et al.Chloride channels:often enigmatic，rarely predictable［J］.Annu Rev Physiol，2010，72:95－121.

［9］ 焦东军，岳 朋，杜智敏，等.氯通道阻滞剂抑制人肾小球系膜细胞增殖［J］.中国药理学通报，2007，23(1):86－90.

［9］ Jiao D J，Yue P，Du Z M，et al.Chloride channel blockers inhibit proliferation of human glomerular mesangial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(1):86 －90.

［10］ Liu B，Linley J E，Du X，et al.The acute nociceptive signals induced by bradykinin in rat sensory neurons are mediated by inhibition of M-type K+channels and activation of Ca2+-activated Clchannels［J］.J Clin Invest，2010，120(4):1240 －52.

［11］陈娅斐，李 婷，安海龙，等.跨膜蛋白16A:钙激活氯通道的最新进展［J］.生物化学与生物物理学进展，2010，37(11):1175－81.

［11］ Chen Y F，Li T，An H L，et al.TMEM16A:Advances in Calcium activated Chloride channel［J］.Prog Biochem Biophys，2010，37(11):1175－81.

［12］ Bao L，Kaldany C，Holmstrand E C，et al.Mapping the BKCa channel's“Ca2+bowl”:side-chains essential for Ca2+sensing［J］.J Gen Physiol，2004，123(5):475 －89.

［13］ Ferrera L，Caputo A，Ubby I，et al.Regulation of TMEM16A chloride channel properties by alternative splicing［J］.J Biol Chem，2009，284(48):33360－8.

［14］ Ousingsawat J，Martins J R， Schreiber R， et al. Loss of TMEM16A causes a defect in epithelial Ca2+-dependent chloride transport［J］.J Biol Chem，2009，284(42):28698 －703.

［15］ Rock J R，Harfe B D.Expression of TMEM16 paralogs during murine embryogenesis［J］.Dev Dyn，2008，237(9):2566 －74.

［16］ Almaca J，Tian Y，Aldehni F，et al.TMEM16 proteins produce volume-regulated chloride currents that are reduced in mice lacking TMEM16A［J］.J Biol Chem，2009，284(42):28571－8.

［17］ Tarran R，Loewen M E，Paradiso A M，et al.Regulation of murine airway surface liquid volume by CFTR and Ca2+-activated Cl－conductances［J］.J Gen Physiol，2002，120(3):407 － 18.

［18］ Currie K P，Wootton J F，Scott R H.Activation of Ca2+-dependent Cl－currents in cultured rat sensory neurones by flash photolysis of DM-nitrophen［J］.J Physiol，1995，482(Pt 2):291 －307.

［19］ Espinosa I，Lee C H，Kim M K，et al.A novel monoclonal antibody against DOG1 is a sensitive and specific marker for gastrointestinal stromal tumors［J］.Am J Surg Pathol，2008，32(2):210－8.

［20］ Hartzell H C，Yu K，Xiao Q，et al.Anoctamin/TMEM16 family members are Ca2+-activated Cl－channels［J］.J Physiol，2009，587(Pt 10):2127－39.

［21］ Das S，Hahn T，Nagata S，et al.NGEP，a prostate-specific plasma membrane protein that promotes the association of LNCaP cells［J］.Cancer Res，2007，67(4):1594 －601.

［22］ Namkung W，Thiagarajah J R，Phuan P W，et al.Inhibition of Ca2+-activated Cl－channels by gallotannins as a possible molecular basis for health benefits of red wine and green tea［J］.FASEB J，2010，24(11):4178－86.

［23］Namkung W，Phuan P W，Verkman A S.TMEM16A inhibitors reveal TMEM16A as a minor component of calcium-activated chloride channel conductance in airway and intestinal epithelial cells［J］.J Biol Chem，2010，286(3):2365－74.

［24］ Manoury B，Tamuleviciute A，Tammaro P.TMEM16A/anoctamin 1 protein mediates calcium-activated chloride currents in pulmonary arterial smooth muscle cells［J］.J Physiol，2010，588(Pt 13):2305－14.