乏氧调控因子miR-210的研究进展*

杨 巍

(苏州大学放射医学与公共卫生学院放射生物学教研室，江苏 苏州 215123)

乏氧调控因子miR-210的研究进展*

杨 巍△

(苏州大学放射医学与公共卫生学院放射生物学教研室，江苏 苏州 215123)

微小RNA; 乏氧; 乏氧诱导因子; 基因表达

乏氧是实体肿瘤发展过程中的普遍现象，肿瘤乏氧细胞的存在使肿瘤对放化疗的抗性增加，更容易侵袭和转移。乏氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIF)调控能量代谢、细胞周期进程和凋亡等相关基因表达使细胞更加适应缺氧微环境，在相关酶或因子的变化过程中起中枢纽带作用。miR-210也参与调控乏氧细胞的生物学功能，在乏氧条件下的表达变化显著，无细胞特异性，已被证实在不同种类的乏氧肿瘤细胞和正常细胞中均以依赖HIF-1的方式表达上调，是目前倍受关注的乏氧诱导型miRNA分子[1]。本文对乏氧过程中miR-210表达的调节机制及其生物学功能作一综述。

1 乏氧与miRNA

乏氧是指由高海拔、贫血或异常的、不充分的血液供给等生理和病理状态引起的可利用氧减少或氧分压降到临界值以下的状态，可限制甚至终止器官、组织和细胞的生理功能。1955年Thomlinson等提出了人体肿瘤中存在着乏氧区的假设，近年来研究证明，正常组织细胞的氧分压为3.2-8.8 kPa，而人和啮齿类动物实体瘤内氧分压为1.33-4.00 kPa，有些部位甚至低于0.33 kPa，距离毛细血管150-200 μm以外的肿瘤区域的氧分压几乎为零[2]。

HIF通过调节与代谢、血管发生、红细胞生成、细胞增殖、分化和凋亡有关的基因表达来调控细胞对缺氧的反应。HIF是由1个对氧分压敏感的α亚基(HIF-1α)和1个组成性的β亚基(HIF-1β)构成的异源二聚体，HIF-1β蛋白在正常与乏氧条件下均持续表达，HIF-1发挥作用主要是由HIF-1α亚基的表达和活性决定的。HIF-1α的蛋白表达和转录活性受细胞内氧浓度的精确调控，发生在mRNA、蛋白、核定位及转录激活等不同层次。在缺氧条件下，稳定的HIF-1α与HIF-1β相互结合形成复合体，调节下游与缺氧相适应及进行自我保护相关基因的表达[3]。

miRNA是一类生物体内自然生成的非编码分子，由21-22个核苷酸组成。在细胞核内，编码miRNA的基因定位于非编码转录本的外显子或内含子区域，首先转录形成较长的带有帽子结构的pri-miRNA，然后这个初级转录子在RNase Ⅲ Drosha和DiGeorge 综合征临界区域8(DiGeorge syndrome critical region-8, DGCR8)蛋白复合物作用下被加工为含有60-70核苷酸长度并具有茎环结构的前体miRNA (pre-miRNA)，再通过转运蛋白(exportin-5)到达胞浆中，在Dicer的参与下形成具有21-22个核苷酸的成熟双链miRNA。随后，双链RNA中的1条单链会与蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)。这个沉默复合体的核心成分是AGO蛋白(argonaute protein)，该蛋白含有一个结构类似于RNase H具有催化活性的P元件诱导无用睾丸(P-element-induced wimpy testis, PIWI)位点，并通过该位点与miRNA的5′端结合。RISC通过5′端第2-8核苷酸与靶mRNA 3′端非翻译区(untranslated region, UTR)部分序列的配对结合抑制RNA翻译或降解靶mRNA。miRNA在转录后水平调节体内30%以上的mRNA[4]。miRNA作为发育、生理、病理状态下的调节因子参与生物体内细胞生长、分化、代谢、病毒感染和肿瘤发生等一系列重要的进程，越来越多的证据表明miRNA的功能类似于癌基因或抑癌基因，在人类恶性肿瘤的发生过程中频繁发生失调[5]。

miRNA在乏氧基因调控过程中也起重要作用。目前发现涉及到调节HIF信号转导上、下游基因通路的miRNA包括：调节HIF-1α的有miR-199a、miR-17-92簇[6]和miR-20b[7]，受HIF调节的有miR-23、miR-24、miR-26、miR107、miR-210和miR-373[8]。2007年首先报道了乏氧能够影响miRNA的表达[9]，随后这一领域的研究进展迅速，尤其是对miR-210的研究，几乎涵盖了乏氧生物学的所有领域。miR-210是目前一致公认的在乏氧的正常或肿瘤细胞中表达变化最显著的miRNA，在生理状态下及恶性肿瘤环境中对乏氧细胞的增殖、凋亡、血管生成、DNA损伤修复和能量代谢起重要作用。

2 乏氧条件下miR-210表达的调节

miR-210的茎环结构序列位于由11 p 15.5染色体上AK123483基因转录生成的非编码RNA的内含子内。通过mRNA的5’7-甲基鸟苷帽子、转录起始位点、CpG岛和多腺苷酸化位点分析，预测人pri-miRNA-210的序列范围与AK123483基因相似，长度为2 927 bp。尽管miR-210确切的生物发生机制还不是很清楚，但是AK123483的转录子可能就是pri-miR-210，进一步产生pre-miR-210和成熟的miR-210[10]。Pasquale等[11]利用real-time PCR和Northern blotting方法检测了1%O2浓度下人脐静脉内皮细胞中miRNA-210的表达，发现乏氧4 h miRNA-210的表达即开始增高，乏氧48 h的表达水平比常氧高约35倍。

miR-210受HIF-1α调控，HIF-1α在接近miRNA-210启动子处直接与转录起始位点上游大约40bp的乏氧反应元件(hypoxia responsive element, HRE)结合[10]。比较各物种间miR-210核心启动子，高度保守的HRE位点体现了miR-210调节乏氧基因表达的重要性[12]。各物种miR-210的HRE附近的其它一些重要的转录因子结合位点如E2Fl、Oct4和过氧化小体增殖剂激活型受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)也高度保守，因此推测miR-210在乏氧进程中扮演重要角色，与细胞周期调控、干细胞生物学和能量代谢息息相关[13]。有趣的是，细胞在乏氧暴露结束后1 d，miR-210表达仍然明显高于常氧水平。乏氧后miR-210长期高表达可能归因于它特别长的半衰期[14]。

3 乏氧条件下miR-210的功能

3.1血管生成 实际上几乎所有实体肿瘤都存在刺激血管生成的缺氧部位以维持肿瘤生长。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是肿瘤血管生成的主要调节因子之一，受乏氧的调控[15]。miR-210可能也参与促进血管新生的过程。在乏氧条件下，miR-210抑制其靶分子-受体酪氨酸激酶配体Ephrin A3(EFNA3)表达，促进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)分化产生毛细血管样结构，并能促进VEGF诱导的HUVECs迁移[14]。常氧下，HUVECs内miR-210表达即可促进血管形成，表明miR-210本身无须乏氧诱导就能加强血管新生。另外，在乳腺癌患者中，miR-210的表达与VEGF、缺氧和血管新生有关[16]。

3.2干细胞和分化 缺血预处理(ischemic preconditioning, IP)是一种重要的细胞保护性刺激。HIF-lα介导的基因表达对缺血预处理发挥保护作用至关重要[17]。作为HIF-lα靶基因的miR-210能够提高间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在缺血、缺氧和再氧合预处理时的生存能力[18]。在大鼠模型中miR-210表达增加也与改善移植间充质干细胞的生存能力有关。miR-210还通过下调Fas凋亡通路中的凋亡前调节因子caspase-8相关蛋白2(caspase-8-associated protein 2, Casp8ap2)，抑制间充质干细胞凋亡。这些研究表明HIF-lα介导的基因表达与缺血预处理之间存在密切联系。

缺氧是抑制干细胞分化的重要环境因子[19]。比较缺氧和常氧条件下小鼠胚胎成纤维细胞的基因表达谱，缺氧时大多数胚胎干细胞特异性基因表达上调，而胚胎成纤维细胞特异性基因表达下调[20]，这表明缺氧创造了更有效的体细胞重新编程的微环境，推测miR-210在细胞缺氧条件下可通过抑制诱导性多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)死亡来加强体细胞基因重排。有报道观察到miR-210还通过抑制激活素A受体1B (lB receptor of activin A, AcvRlb)表达促进成骨细胞分化[21]。可见miR-210是一个多能调节因子，能够通过抑制细胞死亡来调节干细胞的生存，通过促进细胞分化来调节干细胞分化。

3.3细胞周期调控 乏氧在某些细胞中可以通过HIF-1α引起细胞周期阻滞[22]。miR-210是HIF-1α依赖性分子，通过E2F家族成员E2F3和Myc依赖性转录激活和细胞生长拮抗因子(antagonist of Myc-dependent transcriptional activation and cell growth, MNT)调控细胞周期进程。E2F3有2个异构体，E2F3a在细胞周期不同时段表达发生变化，其中G1/S期表达量最高；而E2F3b在细胞周期各时段均为组成性表达。这2个异构体基因有共同的3’UTR位点，miR-210能调节这2个异构体之间的相对平衡，从而调控细胞周期进程[23]，这是由缺氧引起细胞周期阻滞的一个新机制。

研究表明，miR-210还通过下调MNT加快细胞周期的进程[10]。MNT是Myc/Max/Mad网络成员之一。MNT与Max形成异二聚体，再通过与E box DNA序列(CANNTG)结合抑制Myc靶基因表达。E2F3是Myc和miR-210的靶分子，表明miR-210能够在多个靶点上正性或负性调节Myc通路。乏氧条件下HIFs与c-Myc相互作用调节细胞增殖和代谢，因此miR-210能够精确调协Myc信号转导通路。

3.4抑制DNA损伤修复 通过下调DNA损伤修复相关基因如DNA错配修复基因1 (MutL homolog 1,MLH1)、DNA错配修复基因2 (MutS homolog 2,MSH2)和DNA损伤修复蛋白51 (DNA damage repair protein 51,RAD51)等，乏氧可增加癌细胞基因组不稳定性。乏氧抑制DNA损伤修复基因的机制包括：改变MLH1启动子染色体结构的组蛋白去乙酰化，在MSH2启动子处由HIF-1α/SP1替代Myc，以及增强RAD51启动子处抑制性E2F4/p130复合体的结合[24]。miR-210抑制同源重组修复过程中的关键基因RAD52的蛋白表达[8]，但miR-210参与同源重组和癌细胞基因组不稳定性的直接功能证据仍不足。

3.5调节线粒体代谢 氧气充足的情况下，细胞通过三羧酸循环产生能量，1 mol葡萄糖可生成38 moLATP。乏氧条件下，细胞线粒体代谢受抑，能量产生转为糖酵解途径，1 mol葡萄糖只生成2 mol ATP。许多乏氧诱导蛋白参与上述能量产生途径转变过程，如丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶A和细胞色素C氧化酶亚基4-2等。近期研究表明miR-210通过抑制铁-硫簇支架蛋白(iron-sulfur cluster scaffold protein, ISCU)异构体ISCU1和ISCU2，参与调节乏氧条件下线粒体代谢[25]。铁-硫簇蛋白对于顺乌头酸酶在三羧酸循环中催化柠檬酸转变为异柠檬酸起重要作用。乏氧条件下，miR-210通过下调ISCU1和ISCU2，还阻断线粒体复合物I的电子转移活性。

4 肿瘤中miR-210的变化

研究发现许多miRNA基因位于染色体的肿瘤相关区域和脆性位点[26]。若干miRNAs在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调，这一现象初步揭示了肿瘤发生与miRNA表达之间存在相关性。通过比较不同组织类型来源的肿瘤miRNA的表达，发现某些miRNA在肿瘤细胞中最初是下调的，认为miRNA能够作为肿瘤起源和分化状态的预报因子，具有成为癌症诊断因子的潜力[27]。另有研究在几种实体肿瘤中检测到一些miRNA上调，认为至少有一部分miRNA对癌症的发生是有促进作用的[28]。该领域的研究虽刚刚起步，新的发现与观点却层出不穷，miRNA与肿瘤的关系已成为当前众多科学家关注的热点之一。

miR-210在肿瘤中的表达通常是升高的，例如胶质母细胞瘤[29]、黑色素瘤[30]、肾透明细胞癌[31]、胰腺癌[32]和乳腺癌[33]，这与miR-210促进细胞周期进程相一致。然而，miR-210是缺氧条件下变化最明显miRNA，这种过表达可能只是肿瘤乏氧的反应。因此，miR-210表达是否促进肿瘤的发生、发展还有待进一步研究。另外，在某些肿瘤中观察到miR-210表达下降和基因缺失，暗示它具有潜在的抑制肿瘤功能。有研究发现miR-210能够明显地抑制人胰腺癌和头颈癌细胞生长[34]。根据这些研究我们认为miR-210在肿瘤发生和发展过程中的作用具有多面性，它可能是调节细胞自身稳态的重要分子，扰乱细胞内miR-210水平不利于细胞的生存。

鉴于miR-210的表达与肿瘤乏氧的密切关系，血液循环中miR-210水平有可能成为肿瘤病人预后指标。弥散巨大B细胞淋巴瘤患者血清中miR-210水平明显高于健康人[35]，这一报道为血中miR-210可以作为肿瘤的生物标记物提供了令人兴奋的证据。最近在胰腺癌患者血浆中也检测到miR-210水平升高[36]，胰腺肿瘤是高度缺氧的，这些研究表明，血浆中miR-210可以作为肿瘤乏氧无创检测的一种新型生物标志物。

5 展望

自从3年前首个低氧调节的miRNA被报道以来，这方面研究已经有了很快的进展，但科研工作者们仍面临一个巨大挑战-如何精确鉴定miRNA的靶标。计算机预测miRNA的靶标是基于靶基因3’UTR与miRNA的种子序列的互补性。但是，由于miRNA的“种子区域”只由6-7个核苷酸组成，假阳性的预测是这种方法的主要缺点。微阵列分析技术也广泛使用在识别miRNA靶基因上，但是可能遗失一些真正的靶标，因为miRNA的调控机制是在转录后水平抑制靶基因而并非转录水平。AGO蛋白免疫沉淀法(argonaute protein immunoprecipitation，miRNP-IP)是一种有效鉴定miR-210靶基因的方法，可能成为未来实验性鉴定miR-210靶分子的主要手段[37]。理想的模式是将这些技术结合起来绘制miR-210靶标的全图谱，以阐明miR-210在缺氧以及其它通路中的调控作用。

总之，miR-210在细胞对缺氧的反应中起着至关重要的作用，通过结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学等方法分析miR-210表达变化在细胞和动物模型的表型改变，会对其生物学功能有一个更为深入的了解，对于miR-210发展成为一个新型高效的诊断和治疗靶点有重要意义。

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ProgressonhypoxicregulatoryfactormiR-210

YANG Wei

(DepartmentofRadiobiology,SchoolofRadiologicalMedicineandPublicHealth,SoochowUniversity,Suzhou215123,China.E-mail:detachedy@yahoo.com.cn)

The expression of miR-210, a much concerned hypoxia-induced molecule, is significantly changed under the condition of hypoxic microenvironment. The up-regulation of miR-210 depends on the expression of hypoxia-inducible factor in different types of hypoxic tumor cells and normal cells. This review article summarizes the recent progress on the regulation of miR-210 expression and its biological function under hypoxic condition.

MicroRNA; Hypoxia; Hypoxia-inducible factors; Gene expression

1000-4718(2011)04-0813-04

R364.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.038

2010-10-05

2011-01-04

国家自然科学基金青年资助项目(No.30600160); 国家自然科学基金资助项目(No.81071958)

△通讯作者Tel: 0512-65880065; E-mail: detachedy@yahoo.com.cn