探讨内毒素血症兔复制卫气营血证可能性的实验体会

艾碧琛，赵国荣，贺又舜，肖碧跃

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是指感染或非感染因素作用于机体而引起的一种难以控制的全身性瀑布式炎症反应综合征，可以痊愈，也常发展成脓毒性休克和多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。引起SIRS的原因有感染性因素与非感染性因素两个方面，其中感染性因素占70%左右，又以革兰氏阴性细菌为主，但临床上发现革兰氏阴性菌感染使用抗革兰阴性菌的抗生素疗效不佳，于是人们开始注意到细菌产物的作用，近年研究得较多的是内毒素，即脂多糖(LPS)。LPS进入血液循环后，形成内毒素血症，通常可导致SIRS、MODS、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。感染性疾病是温病学研究的主要内容，由感染因素所致的内毒素血症，属中医学“温病”范畴，中医学认为，内毒素血症系外感六淫，或内有郁热，邪毒化火，蓄而成毒，热毒内盛，邪毒内陷而成，温病卫、气、营、血阶段中均存在内毒素血症［1］。叶天士创立的卫气营血辨证至今300多年，一直有效指导临床辨证治疗感染性疾病。随着对SIRS、内毒素血症认识的深入，以及近年中医卫气营血辨证对非典型性肺炎、H1N1流感等疾病的确切防治效果，人们越来越意识到卫气营血辨证诊疗感染性疾病的有效性［2］。因此，卫气营血辨证防治SIRS的研究成为了温病学的新任务。要进行此项研究，动物实验是必不可少的研究途径，我们首先应该在动物实验中找到内毒素血症与温病卫气营血辨证的相关性，才能为进一步的研究提供实验依据。

1 实验材料的选择

发热是温病的基本症状，兔的体温变化十分灵敏，最易产生发热反应，发热反应典型、恒定，所以我们选择兔作为模型动物，以大肠杆菌内毒素(LPS)攻毒，复制内毒素血症模型。实验时，我们所用的兔品种为新西兰大耳白兔;LPS购自美国Sigma公司;血清学为O111:B4，批号118K4052。

2 确定造模方法

根据文献报道，用LPS造内毒素血症或脓毒症兔模型的方法较多，如有的采用家兔耳缘静脉一次注射足剂量 LPS 的方法［3］，也有通过上腔静脉［4］或门静脉［5］、颈静脉［6］持续微量输注 LPS 的方法，还有二次打击造模法，即一次打击后间隔24h后再进行二次打击［5］等等。因为我们的实验目的是寻求内毒素血症与温病卫气营血证候的相关性，参考文献报道的各种造模方法，遵循复制动物模型要尽可能与人类疾病相似的原则，我们认为一次打击更符合临床中温病发生的大多数情况，即感邪即发，同时也考虑到复制动物模型的易行性以及便于今后开展进一步研究的适用性，我们最终选择耳缘静脉一次注射LPS的方式。

关于LPS的注射剂量，因为不同血清型、或相同血清型但不同厂家生产的LPS，即使剂量相同，复制的模型在病理反应和病证特征方面也不具有良好的可重复性［7］，而且此类LPS为酚提取的LPS，该种提取方式可以造成成品中有超过60%的RNA和不超过1%的蛋白，批间差异比较大，所以即使是相同血清型不同批号的LPS，也会产生不一致的实验结果。我们为了寻找实验最合适的内毒素造模剂量，由小到大分别尝试了 1μg/kg、3μg/kg、5μg/kg、10μg/kg 和 15μg/kg 等大小不同的多个剂量，发现 1μg/kg、3μg/kg、5μg/kg 三个剂量攻毒后，实验兔有发热及相关症状体征出现，但症状较轻，大多数很快(不超过8h)恢复正常，不利于观察营分证和血分证，说明这几个剂量毒力较小。于是加大剂量至 10μg/kg、15μg/kg，发现用 15μg/kg 的剂量攻毒后，有接近一半的实验兔在8h内即出现死亡，时间太短，又不利于卫气营血阶段性的观察，而在10μg/kg的攻毒剂量上，实验兔有相对较好的症状体征由轻到重的阶段性表现，最后我们确定10μg/kg为实验中内毒素血症的造模用剂量。

3 分析内毒素血症兔的症状、体征与温病卫气营血证候的相似点

通过反复观察实验兔在LPS攻毒后的症状体征的变化，我们认为在10μg/kg剂量攻毒后，内毒素血症兔出现了较为有规律的三个阶段:第1阶段(攻毒后1～2h)、第2阶段(攻毒后2～6h)，第3阶段(攻毒后6～36h)，并且3个阶段分别与卫、气、营血分证候相似［8］。

3.1 第1阶段症状、体征及其与卫分证的相似点

实验中第1阶段模型兔体温开始升高，心率、呼吸增快，耸毛、发抖、喷嚏，这与温病卫分证温邪初袭人体肌表所致的发热恶寒相似。因为卫分证是温邪初袭卫表，邪正交争于卫分所致，以发热、微恶风寒、口微渴为辨证要点。随着时间增加，在攻毒后接近2h的时候，耸毛、发抖、喷嚏、流涕症状逐渐消失，体温继续升高，同时部分兔开始出现耳廓发热、充血，类似人类温病由卫分逐渐传入气分的传变过程。

3.2 第2阶段症状、体征及其与气分证的相似点

攻毒后的第2～6h内，模型兔出现小便黄、呼吸明显增快增粗、心率增快，耳廓发热、充血明显以及结膜充血，而且攻毒后体温升高的最高值出现在这个阶段内，反映这个阶段热势极盛，这与气分证相似。温病气分证是感邪后，整体气机受郁，正气奋起抗邪，邪正剧争，热炽津伤，以发热不恶寒、口渴、苔黄为主要表现。同时，气分证的病位较为广泛，涉及肺、脾、胃、肠等多脏腑，实验中此阶段有相当一部分兔出现了大便溏泻、水样便或黏液便等，这也反映病位由表入里，类似由卫分证进入气分证。

3.3 第3阶段症状、体征及其与营、血分证的相似点

温病营分证以营热阴伤、扰神窜络为主要特点，身热夜甚、心烦谵语、舌质绛红为辨证要点;血分证以动血耗血、瘀热内阻、进而脏气衰竭为主要病机变化，以急性多部位、多窍道出血、斑疹密布及舌质深绛为其辨证要点。在3阶段即第6～36h内，模型兔体温、呼吸、心率均比2阶段略降，精神逐渐萎靡，活动度和灵敏度明显下降，便血、耳廓发凉、结膜充血明显，出现口周青紫、耳廓青紫或有瘀点瘀斑、眼球突出、鼻衄、嗜睡、全身瘫软无力、角弓反张、抽搐和死亡。这些与温邪入营、扰神窜络的营分证以及动血耗血、瘀热内阻、进而脏气衰竭的血分证相似。但是，我们的实验未能将营分证和血分证二者从症状体征或时间上截然分开。在实验中发现，从气分证向营、血分传变时，更多出现的是由气分越期进入血分、或者出现营分证、血分证重叠，导致二者难以严格区分。

4 实验兔具有较明显的个体差异性

与临床患者有个体差异一样，实验兔也有十分明显的个体差异。如攻毒后，大部分模型兔出现了较为有规律的类似人类卫、气、营、血阶段表现，而有些兔经过2阶段(气分证)后，并没有接着出现3阶段(营分证或血分证)的症状，而是症状和体征逐渐消失，又恢复到正常;还有个别兔在攻毒后2～3h仍然有耸毛、喷嚏、流涕等类似卫分证的表现，这又类似于卫气营血辨证特殊传变中的自愈或不传。而有个别兔在攻毒后5h左右已出现便血;还有一只兔在攻毒后1.5h即出现抽搐而死亡，这又类似“直中肝经”。

5 内毒素血症兔与人类卫气营血证候存在不同

虽然内毒素血症兔表现出了许多与卫气营血证候相似之处，但仍然有一些不同。如在攻毒后至0.5h之间，除了体温升高外，模型兔开始出现懒动、蜷卧、少饮少食等症状，但对人类而言，在感邪的初期，以发热恶寒为主要表现，而没有懒动、蜷卧等症状，少饮少食等在感邪的初期应该也并不明显。再如，一些在温病临床中比较重要的卫气营血证辨证要点的症状体征，如渴饮、烦躁不安等精神方面的改变及舌象变化等，自始至终都没有出现。

6 从中医证候动物实验学的特点来评价实验结果

我们实验的目的是从内毒素血症模型中复制温病卫气营血模型，采用的是病因模拟的方法，即选择造成与临床证型相仿的治病因素(LPS)，作用于动物机体使其产生类似临床证候(卫气营血证候)的模型。但复制中医“证”的动物模型难度较大，因为中医“证”是疾病的病因、病位及病邪性质的概括，且临床多以病人主观感觉反映出来，确切的客观指标又还没有确定下来，所以多数学者认为，目前只有尽可能从“证”的临床辨证标准来评价中医“证”的动物模型［9］。但由于模型动物和人处在生物进化树的不同层次，所以会出现模型动物与人对刺激的反应不同的现象，如整个实验过程中模型兔的舌象变化并不明显;而攻毒初期模型兔即出现懒动、蜷卧、少饮少食等较明显的症状;即使是在第二阶段的高热状态下，也没有观察到渴饮、烦躁不安等精神改变，更不用说心烦谵语这些症状了。

此外，中医证候有相当一部分病情资料，用中医传统的望、闻、问、切诊察方法在动物身上难以收集，所以模型的诊断依据应该可以作非原则性的变通［10］。如发热，古代医家通过缜密的临床观察和思辨，将卫气营血证不同的热型进行定性，借以辨别各证，如卫分证是发热、微恶风寒并见，气分证但热不恶寒，营分证身热夜甚。但是在动物实验中，这些不同的热型是很难表现出来的，不过我们发现体温高低不同阶段是有差异的。如实验结果显示，第1阶段(与卫分证相关)开始出现发热，但热势不高;第2阶段(与气分证相关)的发热程度为三阶段中最高的，而到了第3阶段(与营血分证相关)时，发热程度又有减轻。应该说，三个阶段体温高低的动态变化，与卫分证发热、微恶风寒，气分证但热不恶寒，营分证身热夜甚的热型变化是有一致性的。再看，对人类来说，感邪初期的一个重要症状就是发热恶寒，但恶寒是患者的自我感觉症状，无法在模型兔上检测出来，就只能通过分析恶寒的基本特征，在模型兔身上找到可供诊断的证据，实验中我们观察到在第1阶段，有部分模型兔出现了耸毛，应该就可以看成是恶寒的表现。

综上所述，从中医证候动物实验学的特点来看，其对中医证候动物模型的复制有一定的包容性，只要其表现和体征与“证”的临床表现大致相同，能反映中医“证”的特点，则其模型就可以认为是较为成功的［7］。所以总的来说，从症状和体征来看，实验中的内毒素血症兔模型反映出了较明显的卫分证、气分证、营血分证三类证候特征，从内毒素血症模型复制温病卫气营血模型是可行的。当然，判断建立证候模型的真实性及与临床的一致性，还需要通过实验室指标检测以及治疗反证等途径来判断，我们将在下一步的实验中对此进行完善。

［1］杨爱东，曾兰，屠燕捷，等.不同治法对内毒素血症小鼠肺组织细胞因子的影响［J］.辽宁中医杂志，2007，34(3):358 －360.

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［3］徐丽君，陆付耳，王开富，等.3种温病治法制剂对家兔内毒素血症治疗效果的比较［J］.中国中西医结合急救杂志，2002，9(3):132－134.

［4］杨镛，时德.兔内毒素血症时sCD14、E－选择素和IL－10水平及其与预后的关系［J］.中国普外基础与临床杂志，2002，9(1):10－12.

［5］胡森，盛志勇，周宝桐.MODS动物模型研究进展［J］.中国危重病急救医学，1999，11(8):504 －507.

［6］宗酉明，曾因明.兔内毒素血症时胃黏膜内pH的改变［J］.中华急诊医学杂志，2004，13(4):242 －244.

［7］杨进.中医温病动物模型的研制［J］.中国实验动物学杂志，2002，12(1):62－64.

［8］艾碧琛，赵国荣，贺又舜，等.卫气营血阶段性与内毒素血症兔不同时相症状、体征的相关性研究［J］.湖南中医药大学学报，2011，31(3):10－13.

［9］刘恩歧.医学实验动物学［M］.北京:科学出版社，2008:221.

［10］马健.巴氏杆菌性家兔温病气营传变模型建立的初步研究［J］.中国医药学报，1991，6(2):57－62.