EPO对大鼠肺缺血再灌注损伤时FKN及MCP-1表达的影响

高菡 李建强 张莉娟 赵卉

肺缺血再灌注损伤是指缺血基础上恢复血流灌注后，肺组织细胞损伤加重的病理状态。常见于肺栓塞溶栓和介入治疗、肺移植及体外循环后。随着肺溶栓、介入治疗、肺移植等多项技术的深入开展，如何阻断缺血再灌注对肺的损伤成为临床医生们关注的焦点。

Epo是一种调节红细胞生成的糖蛋白类激素，主要由肾脏近曲小管附近的间质细胞合成和分泌，其基本生理功能是刺激骨髓红细胞的生成和释放。目前临床上主要用Epo治疗肾性贫血以及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血。近年来的研究发现，Epo还具有抗氧化、抗凋亡、促血管生成、调节炎症反应等作用，EPO受体在全身多个器官，如心、脑、肾、小肠、肺均有表达[1]，目前已有研究证实，EPO对心、脑、肾、肝脏等器官[2-5]的缺血再灌注有保护作用。但有关肺缺血再灌注损伤保护作用方面的报道较少。本研究旨在探讨EPO在肺缺血再灌注中是否亦有保护作用以及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠72只（山西医科大学动物中心提供），体重200～300g。

1.2 主要试剂及仪器 重组人促红细胞生成素（rhEPO北京四环生物工程制品厂），戊巴比妥钠注射液（上海剂三厂）、fractalkine PV免疫组化试剂盒（北京中衫金桥公司），MCP-1 ELISA试剂盒（美国R＆D进口分装公司）、动物呼吸机。

1.3 实验动物与分组 健康雄性Wistar大鼠72只随机分为三组，每组24只。假手术组（A组）：只开胸游离右肺门，无其他特殊处理。缺血再灌注组（B组）：开胸游离右肺门后，夹闭肺门阻断45 min，分别再灌注60min、120min。EPO干预组（C组）：综合参考Haiwei Wu[6-7]等给药方法，于术前2h腹腔注射rhEPO（5000U/kg）。余处理同B组。

1.4 动物模型的建立 健康Wistar大鼠，3％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉后，尾静脉注射肝素（100U/kg）。仰卧位固定，气管切开后插管，接动物呼吸机行机械通气（吸入室内空气，呼吸频率60次/min，潮气量单侧肺通气8～10mL/kg，双侧肺通气15～20mL/kg，吸呼比为1∶2），然后经胸骨右缘第3～5肋间开胸，离断右肺下韧带，游离右肺门，下穿手术线，于呼气末结扎右肺门（右主支气管，右肺动、静脉），夹闭45min后开放60min及120min，制成在体肺缺血再灌注模型。

1.5 标本采集及检测方法 各组分别于缺血45min、再灌注60min、120min 3个时点采集标本。

1.5.1 免疫组化法测肺组织fractalkine 采用免疫组织化学染色（PV）法检测大鼠肺组织fractalkine蛋白的表达。应用图像分析系统进行图像分析，结果以平均光密度值（OD）表示。

1.5.2 ELASA法检测血浆中MCP-1的含量 根据标准品制作标准曲线，再根据样品吸光度值计算出对应浓度。

1.5.3 病理检查

1.5.3.1 肉眼观察 肺脏颜色、有无出血点、弹性等。

1.5.3.2 光镜下病理变化 取右肺中叶约1cm×1cm×1cm大小组织块，用10％甲醛固定，予以常规石蜡包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.5.4 肺组织W/D 取1g右肺组织用分析天平称重为湿质量（W），置于70℃电热恒温干燥箱中烤48h后称重为干质量（D），二者之比即为W/D。

表1 各组大鼠各时间点FKN、MCP-1的表达及W/D值的变化±s）

表1 各组大鼠各时间点FKN、MCP-1的表达及W/D值的变化±s）

注：与A组相比，aP＜0.05；与B组相比，bP＜0.05

FKN（OD值） MCP-1（ng/L） W/D A组 缺血45min 0.175±0.013 24.95±4.61 4.46±0.32缺血再灌1h 0.184±0.013 25.00±4.14 4.51±0.40缺血再灌2h 0.195±0.008 26.35±4.18 4.69±0.51 B组 缺血45min 0.237±0.014a 38.66±5.35a 4.83±0.64缺血再灌1h 0.294±0.022a 41.26±7.09a 5.67±0.46a缺血再灌2h 0.392±0.025a 60.62±10.33a 6.37±0.32a C组 缺血45min 0.226±0.024a 37.35±8.29a 4.61±0.35缺血再灌1h 0.241±0.025ab 40.75±10.74a 5.47±0.31a缺血再灌2h 0.283±0.031ab 51.09±10.85ab 5.92±0.40ab

1.6 统计学处理 计数资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行多组资料的方差分析，各时点组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理检查

2.1.1 肉眼见 A组肺组织呈淡粉色，光滑有弹性，无出血点。B组可见多处出血点，弹性差，色暗红，再灌2h时点标本可见片状出血。C组可见散在出血点，较B组减少，弹性较差，色暗红。

2.1.2 光镜下见 A组肺泡腔完整，肺泡间隔均匀一致，无明显充血、水肿、炎性细胞浸润。B组肺间质毛细血管充血，肺泡间隔明显增厚，大量炎性细胞浸润，肺泡腔内可见血细胞渗出及渗液积聚，且损伤程度随再灌注时间增长而加重。C组肺泡壁略厚，间质毛细血管充血程度降低，肺泡间隔炎性细胞浸润及肺泡腔出血、渗出程度于相同时间点与B组比较均明显减轻。

2.2 肺组织FKN（fractalkine）的表达变化 FKN阳性细胞胞质和胞膜着色成棕黄色。B组肺组织表达高水平fractalkine蛋白，主要分布在肺泡上皮细胞、小支气管上皮细胞和血管内皮细胞。对肺组织中FKN表达进行相对定量，用平均光密度值（OD）表示。A组表达弱，B组表达明显增强，C组较B组表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05），B组和A组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 血浆中MCP-1含量 与A组比较，B组各时相点含量明显增加（P＜0.05），C组经EPO干预后MCP-1含量与B组比较在再灌2h时点明显下降（P＜0.05）。见表1。

2.4 肺组织W/D A组大鼠肺组织W/D比值随时间延长变化不显著，差异无统计学意义；再灌注后，B组肺组织W/D比值随再灌时间延长呈进行性升高；C组经EPO干预后肺组织W/D比值较B组明显降低，但仍高于假手术组。

3 讨论

肺缺血再灌注损伤（LIRI）主要有如下几种机制：①氧自由基的释放及脂质过氧化反应；②细胞内的钙稳态失调；③炎性细胞大量浸润及炎性介质的释放引起的过度的炎症反应；④细胞凋亡。以上几种因素互为因果、相互促进，最终使得肺毛细血管内皮细胞受损、血管通透性增加、渗出增多、肺泡间隔增厚，最终导致肺脏气体交换等功能受损，引发呼吸衰竭及肺水肿等。

EPO目前在临床上应用于各种原因导致的贫血。但EPO受体在组织中分布的广泛性，提示EPO的作用可能并非仅局限于造血系统。国内外已有研究发现EPO可以通过上调bcl-xl基因、抑制细胞色素C的释放、增加SOD活性抗氧化作用，以及上调Na-KATP酶等多条途径在减少重要器官诸如心、脑、肾、肝等缺血再灌注损伤时起着举足轻重的保护作用。EPO受体在肺脏亦有表达，说明EPO对肺脏可能亦有相关作用。有研究表明，EPO可以抑制NF-κB活化来保护高氧所致的肺损伤[8]，同时可以保护脂多糖引起的肺损伤[9]。

大量的研究已表明炎性细胞在肺组织内的聚集与活化是肺缺血再灌注损伤发生的重要机制。炎性细胞活化后可释放大量炎性介质，它们与上述引起肺缺血再灌注的几种基本机制相互作用、相互促进，最终引起炎性因子瀑布式释放，导致缺血再灌注损伤。炎性细胞在肺组织内的募集是多步骤的过程，有很多因素参与其过程，其中包括炎性趋化因子。它可以协助炎性细胞的黏附与迁徙，促进炎性细胞在肺泡间隔的浸润。因此，作为炎性通路上始动因子的炎性趋化因子的含量变化可以预示并反映缺血再灌注损伤的严重程度。本实验旨在通过测定炎性趋化因子不同家族的两个代表FKN、MCP-1在各组各时点的变化情况，探讨EPO对肺缺血再灌注的作用及可能存在的机制。实验中所用试剂rHuEPO是用重组DNA技术生产的含有与天然分离的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白，具有与天然EPO相同的生物学活性。

FKN（Fractalkine）和MCP-1分别是趋化因子CX3C家族及CC家族的成员。FKN广泛表达在大鼠的心、脑、肺、肾、骨骼肌和睾丸组织中[10]。它可以参与淋巴细胞、单核细胞以及中性粒细胞的募集和它们与血管内皮细胞的黏附并导致血管内皮细胞的损伤等过程[11]。MCP-1主要功能是趋化和激活单核巨噬细胞，诱导单核细胞、内皮细胞表达黏附分子，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集[12]。

本实验结果显示，①肉眼所见术后取下的肺大体标本随着再灌时间的延长，损伤加重（肺的弹性降低，出血点增加甚至融合成呈片状）。给予rhEPO干预后，损伤程度有所下降，光镜下所见亦印证了该结论。②B组与A组各时间点纵向比较，FKN及MCP-1的表达均明显升高，且B组随着再灌注时间的延长，FKN及MCP-1均呈升高趋势。③C组FKN、MCP-1表达水平较B组均有所降低。④C组与B组比较，反应肺微血管损伤及水肿程度的肺W/D亦下降。

上述结果说明，rhEPO可减缓肺缺血再灌注损伤。FKN、MCP-1均参与了大鼠肺缺血再灌注损伤的过程，给予rhEPO干预后可显著降低二者的表达。可以推测：EPO产生保护作用可能是通过减少炎性趋化因子如FKN及MCP-1的表达，从而抑制炎性细胞浸润、减少炎性因子的释放来实现的。

本实验从炎性通路这一角度探讨了EPO对肺缺血再灌注损伤产生保护作用的机制，为拓宽EPO在临床上的应用提供了潜在的可能性，但其远期作用及临床具体应用仍需进一步研究。

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