肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV 2细胞环氧合酶2表达的影响*

崔春爱,毛 翘,金德山,张庆镐

(延边大学基础医学院,吉林延吉 133000）

神经退行性疾病是一系列以神经元凋亡为特征的神经疾病的总称,可导致学习和记忆力下降,如阿尔茨海默病(alzheimer's disease,AD)、帕金森病(parkinson's disease)及亨廷顿病(huntington's disease,HD)等[1]。流行病学研究表明,长时间应用非甾体类消炎药可降低患AD的危险性,改善症状,但易导致胃肠道出血,长期服用时具有一定的危险性。肉豆蔻提取物是从肉豆蔻科高大乔木植物Myristica fragrans中提取的天然成分,常作食用佐料[2-3],并可抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠脑内小胶质细胞的激活及空间学习记忆的降低[4-6]。小胶质细胞作为中枢神经系统内的免疫细胞,既可通过吞噬脑组织中的病原体及有害颗粒对神经元起保护作用,又可在致炎因子的作用下激活成反应性小胶质细胞,分泌炎性细胞因子,对神经元起毒性作用[7-8],是治疗神经炎症及神经退行性疾病的一个重要靶点[9-10],本课题主要对小胶质细胞功能的调控进行研究,使其向保护神经元的方向发展。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 小鼠小胶质BV 2细胞购自韩国细胞株银行;DM EM细胞培养基及小牛血清为GIBCO公司产品;WST-8试剂盒为日本株式会社同仁化学研究所Dojindo产品;LPS、兔抗小鼠环氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及常规试剂均购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养 小鼠小胶质BV 2细胞以适量细胞密度接种于培养瓶中,加入含10%小牛血清、100 U/m L青霉素及100 μg/m L链霉素的DM EM 培养液,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中常规培养、传代。

1.3 WST-8法检测 将对数生长期小鼠小胶质BV 2细胞密度调整至1×105个/m L,接种于96孔板。将细胞分为对照组及肉豆蔻组。对照组加等量生理盐水;肉豆蔻组用质量浓度为10、20、50μg/m L的肉豆蔻提取物处理小鼠小胶质 BV2细胞。培养22 h后,加入WST-8试剂10μL/孔,再培养2 h,用450 nm波长测定吸光度。每组设8复孔、实验重复3次,取平均值,检测肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV 2细胞生存率的影响。

1.4 形态学观察 将对数生长期小鼠小胶质BV 2细胞密度调整至1×105个/m L,接种于直径为60 mm的培养皿上,细胞贴壁后,实验分对照组(等量生理盐水)、谷氨酸组(谷氨酸终浓度为5μg/m L)及谷氨酸-肉豆蔻联合组(终浓度为5μg/m L的谷氨酸及20μg/m L的肉豆蔻提取物),细胞分组处理24 h后,在倒置显微镜下进行观察。

1.5 Western Blot检测 接种于培养基的细胞完全贴壁后,实验分对照组(等量生理盐水)、LPS组(LPS终浓度为1μg/m L)及 LPS-肉豆蔻联合组(终浓度为1μg/m L的LPS及终浓度分别为 10、20、50μg/m L的肉豆蔻提取物)。培养24 h后,在冰上收集细胞,提取蛋白质。样品上样于10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶,在电压70～100 V电泳 1.5～2 h,转膜至二氟化树脂膜(polyviny lidene fluoridemembrane,PVDF)上,5%脱脂奶粉封闭1 h,兔抗小鼠COX-2多克隆抗体(1∶1000)为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5000)为二抗进行反应,增强型化学发光剂(enhanced chem iluminescence,ECL)显色后观察。

1.6 统计学处理 采用Statuiew(SAS Inc)软件,实验数据采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV 2细胞生存率的影响WST-8法检测显示,肉豆蔻提取物作用于小鼠小胶质BV 2细胞24 h,不同质量浓度的肉豆蔻提取物组与对照组相比,细胞生存率无明显影响(见图1),表明肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2细胞无毒性作用。

图1 肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2细胞生存率的影响

2.2 谷氨酸及肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2细胞形态学的影响 谷氨酸是小胶质细胞被激活后产生的兴奋性神经毒物质,在神经细胞缺血、缺氧、退行性病变及炎症损伤等方面发挥重要作用。本实验对照组的细胞呈圆形或椭圆形,细胞间连接紧密,生长旺盛(见图2A);谷氨酸组细胞肿胀,部分细胞脱壁、悬浮,增殖减慢,细胞周围碎片增多(见图2B);谷氮酸-肉豆蔻联合组细胞呈圆形或椭圆形,细胞间连接紧密,细胞生长旺盛(见图2C),表明肉豆蔻提取物抑制了谷氨酸对小鼠小胶质BV2细胞的损害作用,显示其神经保护作用。

图2 小鼠小胶质BV 2细胞的形态学观察(倒置显微镜 ×40)

图3 LPS和肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV 2细胞COX-2表达的影响

2.3 LPS及肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV 2细胞COX-2表达的影响 与对照组相比,LPS组COX-2的表达明显增加,LPS(1μg/m L)分别与终浓度为10、20、50μg/m L的肉豆蔻提取物联合处理后,COX-2的表达随浓度的增加而减少(图3A)。将Western Blot表达结果,运用Sigmap lot软件进行量化,显示LPS组与对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。LPS-肉豆蔻联合组与 LPS组之间差异有统计学意义(P＜0.05)(见图3B),表明肉豆蔻提取物可抑制一些炎症因子的释放,具有抗炎作用。

3 讨 论

AD是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。AD的关键性特征之一是脑内神经炎症反应。β淀粉样蛋白沉积,激活小胶质细胞引起的炎症反应是其主要病理机制[11]。AD患者脑内激活的小胶质细胞,产生大量过氧化物、谷氨酸、一氧化氮、ATP、神经生长因子(nerve grow th factor,NGF)及一些前炎症细胞因子,具有潜在神经毒性作用。M yristica fragrans是肉豆蔻科高大乔木植物肉豆蔻,具有抗血小板凝集、抗真菌及抗炎等多种作用[12-14]。本实验肉豆蔻提取物作用于小鼠小胶质BV2细胞24 h后,细胞生存率与对照组相比,无显著差异,提示其对细胞无毒性作用;肉豆蔻提取物还可抑制由谷氨酸所导致的小鼠小胶质BV 2细胞形态学改变,表明其对小胶质细胞具有神经保护作用。COX-2是花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶,在受到 LPS及炎症因子等刺激后,呈诱导型高表达,是炎症过程中的诱导酶,通过调节氧化应激和炎症反应参与各种疾病的发病过程[15]。COX-2的表达调控主要在转录水平,即细胞受到细胞内外的各种刺激后,经过一系列的信号传导促进COX-2转录及表达。LPS也称为细菌内毒素,可刺激大鼠神经细胞产生炎症因子。本课题前期研究采用微型渗透泵将LPS以0.25μL/h的速度自动注入大鼠第四脑室达28 d后,大鼠的空间学习和记忆能力受到影响,在大脑海马区可见到大量被兔抗鼠单克隆OX-6抗体染成灰色的具有活性的小胶质细胞[4]。本实验中,LPS明显增加小鼠小胶质BV 2细胞的COX-2蛋白表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),与在体实验相符;LPS与肉豆蔻提取物联合处理后细胞COX-2的表达随药物浓度的增加而减少,与LPS组之间差异有统计学意义,提示肉豆蔻提取物发挥了抗炎作用。

综上所述,肉豆蔻提取物抑制LPS所诱导的小胶质细胞的激活及炎症因子的释放,这可能是其抑制神经炎症的发生和发展,提高学习和记忆能力的重要机制之一。

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